广州市某马术俱乐部马源大肠杆菌的分离鉴定、毒力基因检测及耐药性分析

刘 鏊，马丁允，陀海欣，李 静，王超男，孙铭飞，林栩慧，齐 萌

（1.塔里木大学动物科学与技术学院/新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆 阿拉尔843300；2.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东 广州 510640）

大肠杆菌（Escherichia coli）是人和动物常见的病原菌之一，感染后可引起宿主消化系统、泌尿系统及中枢神经系统疾病［1］。大肠杆菌可通过污染的环境、水源或食物等多种途径进行传播。随着抗菌药物的长期广泛使用，致病性大肠杆菌呈现多重耐药性，其耐药因子可在人和动物之间进行传播，给公共卫生安全和畜牧业生产带来较大威胁［2］。马感染大肠杆菌后，可出现腹泻、腹痛、脱水等症状，排出腥臭味粪便，部分马匹表现出肌肉震颤，感染严重时会死亡。李宏博［3］调查发现新疆维吾尔自治区昭苏县散养牧马肛拭子中大肠杆菌分离率较高，为91.30%（42/46）；左勇等［4］报道新疆维吾尔自治区某草场散养牧马感染大肠杆菌后死亡率较高，为21.11%（19/90），造成较大经济损失；Kennedy 等［5］从爱尔兰某马术俱乐部患有肠炎的马驹腹泻粪便样本和常规检查的粪便样本中分离出83 株大肠杆菌，其中，血清型为O19A、O40、O101 和O153 的大肠杆菌均可以感染人，提示马源大肠杆菌具有潜在的人兽共患风险。随着我国赛马业和其他马术运动的蓬勃发展，赛马养殖数量不断增加，有关赛马源大肠杆菌分离株毒力基因检测和耐药性研究的数据较少。该研究旨在了解广州市某马术俱乐部赛马源大肠杆菌的携带情况，分析其毒力基因流行情况和耐药性，为我国马大肠杆菌病的临床防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 赛马粪便样本的收集

从广州市某马术俱乐部选取外观健康的20匹4 岁以上成年雌性赛马，用一次性无菌手套经直肠收集粪便样本，每份样本30～50 g，分别装入洁净采样袋，置于带有冰块的泡沫箱中带回实验室，随后进行细菌学培养。

1.1.2 主要试剂和仪器

胰酪大豆胨液体培养基（TSB）和伊红美蓝琼脂培养基（EMB）购自北京奥博星生物技术有限责任公司；革兰染色液参考《兽医微生物学实验指导》［6］配制；细菌基因组DNA 提取试剂盒、Easy Taq Mix 酶和DL 2 000 DNA Marker 购自北京全式金生物技术股份有限公司；PCR 仪、凝胶成像系统和电泳仪购自Bio-Rad 公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离纯化和形态学观察

取0.5 g 赛马粪便样本，使用无菌接种环挑取转移至5 mL 灭菌后的TSB 肉汤中，37 ℃振荡过夜培养。使用无菌接种环蘸取菌液，划线接种于EMB 平板上，37 ℃恒温培养24 h 后，肉眼观察菌落形态，挑取带有黑色金属光泽的单菌落进行纯化培养，培养后挑取单菌落进行革兰染色，普通光学显微镜下观察细菌的形态。

1.2.2 细菌16S rDNA 的PCR 扩增和序列分析

按照细菌基因组DNA 提取试剂盒操作步骤提取分离菌株的基因组DNA，参照文献［7］设计细菌16S rDNA 通用引物，上游引物序列为：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3＇，下游引物序列为：5＇-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3＇，目的片段大小为1 500 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 扩增体系为25 μL：2×Easy Taq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 个循环；72 ℃延伸7 min。以ddH2O 作为阴性对照，PCR 扩增结束后，产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测观察，将成功扩增的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序和拼接。所获序列在NCBI 数据库中进行Blast 搜索，下载相似参考序列，根据比对结果鉴定细菌种类。

1.2.3 大肠杆菌系统发育群鉴定

参照Clermont 等［8］报道的方法，设计大肠杆菌系统进化分群基因特异性引物，chuA 基因上游引 物 序 列 为：5＇-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3＇，下游引物序列为：5＇-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3＇，目的片段为279 bp；yjaA 基因上游引物序 列 为：5＇-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3＇，下游 引 物 序 列 为：5＇-ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3＇，目的片段为211 bp；TspE4.C2 基因上游引 物 序 列 为：5＇-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3＇，下游引物序列为：5＇-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3＇，目的片段为152 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 扩增体系为25 μL：2×Easy Taq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL，上、下 游 引 物 各0.8 μL，DNA 模 板1 μL，ddH2O 9.9 μL。PCR 扩增程序：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；72℃延伸10 min。以ddH2O 作为阴性对照，PCR 扩增结束后，产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测观察。

1.2.4 大肠杆菌毒力基因和耐药基因检测

参照文献［9-11］设计大肠杆菌10 种毒力基因和11 种耐药基因特异性引物，引物序列见表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 扩增体系为25 μL：2×Easy Taq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。毒力基因和耐药基因PCR扩增程序均为35 个循环，退火温度和目的片段大小见表1 和表2。PCR 扩增结束后，产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测观察。

表1 大肠杆菌毒力基因PCR 扩增引物信息

表2 大肠杆菌耐药基因PCR 扩增引物信息

1.2.5 大肠杆菌药物敏感性试验

参照美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2018 年 推荐的标准K-B 纸片法，选取常用的8 类10 种抗菌药物进行药物敏性试验。将药敏纸片紧贴于培养基表面，每株菌每种药物设置3 个重复，37 ℃培养后测量抑菌圈直径，判定药物敏感性试验结果。

2 结果与分析

2.1 分离菌株形态学观察结果

20 份赛马粪便样本经TSB 液体培养基37 ℃培养12 h 后，有13 份液体培养基出现浑浊现象，蘸取菌液划线于EMB 培养基，37 ℃恒温培养24 h后，生长出紫黑色、表面光滑、有金属光泽的圆形单个菌落 （见图1A）；挑取单个菌落进行革兰染色，在普通光学显微镜下可见，细菌呈两端钝圆、散列的革兰阴性短杆菌 （见图1B）。经形态学观察，13 株分离菌初步鉴定为大肠杆菌。

图1 分离菌株形态学观察结果

2.2 分离菌株16S rDNA 的PCR 扩增及序列分析

基于细菌16S rDNA，对13 株分离菌基因组DNA 样本进行PCR 扩增。结果显示，13 份样本均在1 500 bp 左右处出现条带，与目的片段大小一致（见图2）。根据序列比对结果，13 条16S rDNA序列中，有2 条与我国吉林省长春市大肠杆菌分离株序列（GenBank 登录号：MK621229）同源性为100%（n=2）；1 条与挪威大肠杆菌NMBU-W13E19分离株序列（GenBank 登录号：CP043406）同源性为100%（n=1）；1 条与我国新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市大肠杆菌分离株序列（GenBank 登录号：MN704518.1）同源性为100%（n=1）；1 条与哈萨克斯坦酸奶样品大肠杆菌分离株序列 （GenBank 登录号：MT416422）同源性为100%（n=1）；1 条与日本宫崎县大肠杆菌分离株序列（GenBank 登录号：AP027191）同源性为100%（n=1）；1 条与我国江苏省南京市猪源大肠杆菌分离株序列 （GenBank 登录号：MH671454）同源性为100%（n=1）；2 条与加拿大大肠杆菌分离株序列 （GenBank 登录号：CP092500）同源性为100%（n=2）；1 条与韩国首尔市大肠杆菌分离株序列 （GenBank 登录号：CP082835）同源性为100%（n=1）；1 条与美国佛罗里达州大肠杆菌分离株序列 （GenBank 登录号：CP043487）同源性为100%（n=1）；1 条与柬埔寨猪肉样品大肠杆菌分离株序列 （GenBank 登录号：CP044291）同源性为100%（n=1）；1 条与印度奥迪萨邦湖泊沉淀物大肠杆菌分离株序列（GenBank登录号：MH255532）同源性为100%（n=1）。结合形态学观察和16S rDNA 序列比对结果，13 株分离菌均为大肠杆菌。该马术俱乐部赛马粪便样本中大肠杆菌的分离率为65.00%（13/20）。

图2 分离菌株16S rDNA 的PCR 扩增产物电泳结果

2.3 大肠杆菌分离株系统发育群鉴定结果

大肠杆菌分离株的系统进化分群基因PCR检测结果显示（见图3），13 株菌被分为3 个种群，其 中，A 群 占23.07%（3/13），B1 群 占61.54%（8/13），D 群占15.38%（2/13）。

2.4 大肠杆菌分离株毒力基因检测结果

对13 株大肠杆菌分离株进行10 种毒力基因PCR 检测，检出5 种毒力基因，分别为fimC（61.54%，8/13）、fyuA（7.69%，1/13）、irp2（7.69%，1/13）、stx1（15.38%，2/13）和stx2（7.69%，1/13），未检测到其他毒力基因。

2.5 大肠杆菌分离株耐药基因检测结果

对13 株大肠杆菌分离株进行11 种耐药基因PCR 检测，检出9 种耐药基因，分别为parC（100%，13/13）、gyrA（100%，13/13）、gyrB（92.31%，12/13）、sul2 （76.92%，10/13）、cmlA （30.77%，4/13）、aadA（23.07%，3/13）、tet（B）（15.38%，2/13）、blaTEM（7.69%，1/13）和blaCTX（7.69%，1/13），Aph（3＇）和floR 基因未检出。

2.6 大肠杆菌分离株药物敏感性试验结果

药物敏感性试验结果显示，13 株大肠杆菌分离株对头孢西丁、庆大霉素和环丙沙星敏感，对四环素的耐药率为38.46%，对头孢噻呋、阿米卡星、氨苄西林的耐药率均为30.77%，对甲氧苄啶/磺胺异噁唑的耐药率为23.07%，对氯霉素和亚胺培南的耐药率均为7.69%（见表3）。

表3 大肠杆菌分离株药物敏感性试验结果

3 讨论

大肠杆菌是一种条件性致病菌。饲养管理条件差容易诱发马匹大肠杆菌病，给马产业的健康发展带来较大经济损失［12］。Clermont 等［13］利用分子生物学方法，将大肠杆菌分为7 个系统类群，分别为A、B1、B2、C、D、E 和F，其中，B2 群和D 群是常见的人兽共患系统类群。Kennedy 等［5］从爱尔兰马驹腹泻粪便样本中分离到83 株大肠杆菌，经系统分群鉴定，以A 群为主要类群，所占比例为56.62%（47/83），其他类群所占比例依次为D 群（22.89%，19/83）、B1 群（14.46%，12/83）和B2 群（6.02%，5/83）。该研究发现广州某马术俱乐部赛马源13 株大肠杆菌以B1 群为主要类群，所占比例为61.54%（8/13），A 群和D 群所占比例分别为23.07%（3/13）和15.38%（2/13），未检出B2 群，提示不同国家和地区的马源大肠杆菌系统进化分群存在一定差异，应进一步扩大调查地区范围和调查样本数量。

该研究毒力基因检测结果显示，13 株赛马源大肠杆菌分离株携带5 种毒力基因，fimC 基因所占比例最高，为61.54%（8/13），该基因在大肠杆菌黏附与定植过程中起着重要作用［8］；irp2 和fyuA是毒力岛中重要的铁调控基因，存在于大肠杆菌强致病性菌株中，与致病性密切相关；stx1 和stx2参与大肠杆菌致使宿主细胞凋亡的过程［14］。毒力基因检测结果提示，健康赛马肠道内的大肠杆菌具有潜在的致病力。

Chung 等［15］对 韩 国296 株 赛 马 源 大 肠 杆 菌进行11 种耐药基因检测，发现以β-内酰胺类blaTEM基因检出率较高，为60.13%（178/296）；江婉琳等［14］对新疆维吾尔自治区阿克苏地区51 株奶牛粪源大肠杆菌进行24 种耐药基因检测，发现以β-内酰胺类blaTEM基因检出率最高，为100%（51/51）；佟盼盼等［16］对新疆维吾尔自治区154 株腹泻仔猪源大肠杆菌进行12 种耐药基因检测，发现以四环素类tet（A）基因检出率较高，为88.31%（136/154）。该研究耐药基因检测结果显示，以喹诺酮类耐药基因检出率较高，其中，parC 和gyrA基因检出率均为100%（13/13），gyrB 基因检出率为92.31%（12/13）。上述研究结果表明，不同地区和不同养殖条件下，畜主对动物临床用药存在差异，其流行的大肠杆菌耐药基因不同。该研究结果提示，今后对该马术俱乐部赛马进行用药时，应考虑更换氟喹诺酮类药物。

Yigin［17］从阿拉伯马粪便样本中分离出200 株大肠杆菌，评价了分离菌株对14 种抗菌药物的敏感性，结果显示，分离菌株对庆大霉素、氨苄西林、阿米卡星、四环素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐药率 分 别 为26.65% （53/200）、81.50% （163/200）、6.00%（12/200）、61.00%（122/200）和47.00%（94/200）。Reshadi 等［18］从伊朗65 匹健康马直肠拭子中分离出65 株大肠杆菌，分析了分离菌株对7 种抗菌药物的敏感性，结果显示，分离菌株对阿莫西林和头孢曲松的耐药率分别为46.15%（30/65）和38.46%（25/65）。该研究药敏性试验结果显示，13株赛马粪便源大肠杆菌分离株对头孢西丁、庆大霉素和环丙沙星敏感，对四环素、头孢噻呋、阿米卡星、氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、氯霉素和亚胺培南表现出不同程度的耐药性，耐药率在7.69%（1/13）～38.46%（5/13）。该研究结果表明，不同地区马源大肠杆菌耐药性存在差异，与动物饲养管理和用药情况密切相关，应进一步加强马大肠杆菌病的检测和合理用药。

4 结论

广州市某马术俱乐部赛马源大肠杆菌种群具有多样性，携带多种毒力基因和耐药基因，呈现多重耐药性，提示临床上应加强马大肠杆菌病的防治。