鸡传染性支气管炎病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与初步应用

2023-03-04崔鹤馨呼延含蓉

畜禽业 2023年6期

崔鹤馨,呼延含蓉

1.吉林省畜牧兽医科学研究院,吉林长春 130021; 2.吉林省动物疫病预防控制中心,吉林长春 130021

0 引言

鸡传染性支气管炎属于鸡二类传染病,以呼吸困难、打喷嚏、啰音、咳嗽为典型临床症状,该类病症主要由传染性支气管炎病毒引起,属于呼吸道系统传染病,可以通过垫草、饮水、饲料等渠道传播。如果养殖环境通风不良,饲养密度过大或舍内阴湿、高温等均容易诱发该病,冬季发病最为严重。鸡传染性支气管炎主要危害1～2周龄雏鸡,在雏鸡中发病率较高,为2%～5%,如果检验、诊断、防控不及时可能导致整个鸡舍内产蛋鸡、成年鸡染病,因此应该对疑似病鸡进行及时检测,为后续隔离、治疗等提供科学依据。文章主要以荧光RT-PCR检测方法为例,分析该类检测方法在鸡传染性支气管炎病毒中的诊断和应用,旨在进一步发挥该类分子生物学检测技术在鸡传染性支气管炎中的检测作用。

1 试验材料

1.1 病料采集

在2022年4月某养鸡场选择疑似传染性支气管炎病例6例,疑似病鸡日龄为7～34 d,主要临床症状为流泪、流鼻涕、打喷嚏,夜间有明显嘶哑叫声,张嘴呼吸,咳嗽,鼻部肿胀,部分疑似病鸡食欲不振,缩头闭目,拉黄色稀粪。为对病鸡进行进一步确诊,同时便于后续分离病毒,选择病死鸡支气管、气管等病毒易增殖的主要部位作为病料采集部位。如果病鸡临床症状持续15 d以上,可以采集病死鸡盲肠扁桃体或者输卵管、肾脏作为病料。

1.2 试剂与仪器

1)本次试验所需试剂:青霉素-链霉素双抗,由大连宝生物工程有限公司生产;小提质粒DNA试剂盒,由美国Bio-Tek公司生产;胰蛋白酶,由杭州浦泰生物科技有限公司生产;Trans5α感受态细胞,由北京全式金生物科技有限公司生产;PCR PreMixture(2×),由成都飞克天泰科技有限公司生产;Tris-饱和粉(ph8.0),由成都飞克天泰科技有限公司生产;SDS,由润德生物科技有限公司生产;first-Strand Buffer,由厦门慧嘉生物科技有限公司生产,规格200 μL;Rnasin(核糖核酸酶圄制剂),由上海哈灵生物科技有限公司生产;Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒,由德国罗氏生命科学,由北实纵横科学公司代理生产,规格Transcriptase25 μL(20 U/μL);Binding Buffer,由苏州瑞诺德生物科技有限公司生产;Wash Buffer,由美国艾美捷科技有限公司生产。

2)本次试验所需仪器:低温高速离心机,型号5435R,由德国Eppendorf公司生产;恒温可调水溶锅,型号DK-600A,由上海一恒公司生产;立式压力蒸汽灭菌器,型号LDZX-50 KBS,由上海申安公司生产;-80 ℃超低温冰箱,型号Forma 902,由美国Thermo Fisher 公司生产;台式电子秤,型号PL203,由梅特勒托利多公司生产;漩涡混合器,型号QL901,由海门其林贝尔仪器制造有限公司生产;稳压稳流型电泳仪,型号DYY-Ⅲ-8B,由北京市六一仪器厂生产;超净工作台,型号SW-CJ-2FD,由苏州安泰空气技术有限公司生产;微波炉,型号WD900(MG-5523M),由LG电子电器有限公司生产;生化培养箱,型号SPX-450,由宁波莱福科技有限公司生产;PCR仪,型号D-37085,由德国SensoQuert公司生产;紫外凝胶成像分析仪,型号Gel Doc2000,由美国Bio-Rad公司生产;无RNA酶EP管,本生(天津)健康科技有限公司供应,规格50mL、15mL;DNA凝胶回收试剂盒,北京擎科生物科技股份有限公司。

1.3 试剂配置

1)0.01 mol磷酸缓冲液:配置方法为由1/15 mol磷酸二氢钾19 mL,结合磷酸氢二钠81 mL(1/15mol),溶于生理盐水,生理盐水为566 mL。

2)75%乙醇:在焦炭酸二乙酯(DEPC)处理水中加入无水乙醇,其中DEPC为25 mL,无水乙醇为75 mL。

3)10x胰蛋白酶:葡萄糖1 g、氯化钠0.4 g、胰蛋白酶0.5 g,溶于100 mL二胺四乙酸二钠盐(EDTA)+0.2 g去离子水,存放温度为-20 ℃。

4)10xTBX:EDTA 9.3 g溶于去离子水,去离子水约800 mL,取硼酸55g,将pH值调至8.2,之后定溶100 mL。

5)Hank’s液:取七水合硫酸镁0.2 g、氯化钠16 g、六水合氯化镁0.2 g、氯化钾0.8 g,溶于去离子水,去离子水80 mL。之后将10 mL去离子水与氯化钙0.28 g混合定容至100 mL,将以上溶液作为甲液[1]。之后取葡萄糖2 g、十二水合磷酸氢二钠0.304 g、磷酸二氢钾0.12 g,溶于去离子水,去离子水为80 mL,加入0.4%酚红液10 mL,定容至100 mL,作为乙液,放置4 ℃环境保存,之后按照去离子水:甲液:乙液为18：1：1稀释灭菌备用。

6)其他。①第九代尿囊液,利用0.1%新洁尔灭溶液,消毒鸡胚(鸡胚提前冷藏6 h,冷藏温度4 ℃),之后扒出气室,收获第九代尿囊液。②Trizol抽提试剂,主要成分苯酚,为新型总RNA抽提试剂,在溶解细胞时可保持RNA(核糖核酸)完整性。③MDTT,3.09 g二硫苏糖醇+0.01MNaOAc,置于50 mL离心管内,-20 ℃保存。④1%琼浆糖凝胶,取0.5 g琼脂糖、70 mL琼浆糖凝胶电泳,加热煮沸至全部融化。⑤solutionⅠ,10 mM EDTA+Tris-饱和粉(ph8.0)25 mM,高温灭菌后4 ℃保存,solutionⅡ,500 mLSDS、氢氧化钠200 mM,加灭菌水定容500 mL,solutionⅢ,0.5MEDTA、300 mL去离子水溶解,高温灭菌后4 ℃保存。

1.4 引物设计

引物参考序列号GU393332.1,序列TTGCTAGAGAGTGTGC,长度为271bp,位置为398-415(上游引物)[2]。序列AGACTACTTCCTCCTGTTG,长度为271bp,位置为668-650(下游引物),按使用说明进行稀释。

2 试验方法与结果

2.1 荧光RT-PCR检测方法建立

2.1.1 提取BD株毒株RNA

取第九代尿囊液,取BD株病毒,离心10 min,12 000 r/min,后取上清,之后加入1 mL Trizol,取0.2 mL上清液,温室放置5 min,加入氯仿0.2 mL,震荡15 s,定容,温室放置3 min,之后离心15 min,10 000 r/min,离心温度4 ℃。取异丙醇0.5 mL,取上清0.5 mL,颠倒10次以上,混合摇匀,静止20 min,温室下存放,之后离心10 min,10 000 r/min,离心温度4 ℃,弃上清,加入乙醇,乙醇浓度为75%,含量为1 mL,悬浮沉淀,之后离心3 min,5 000 r/min,离心温度4 ℃,剩余少量液体,短暂离心,不吸出沉淀,倒出液体放置温室下晾干,加入DEPC 9 μL,充分溶解RNA,反复吹打,摇匀。

2.1.2 病毒总RNA提取

在无RNA酶EP管中加入Trizol750 μL,温室下搁置10 min,之后加入氯仿200 μL,温室搁置10 min,之后离心15 min,15 000 r/min,收取上清,轻柔吹打8次,搁置30 min之后离心10 min,转速12 000 r/min,弃上层液体,加入75%乙醇,离心10 min,转速8 000 r/min,离心温度4 ℃,温室干燥10 min,之后加入DEPC处理水20 μL,放置-80 ℃环境下保存。

2.2 荧光RT-PCR检测方法应用

2.2.1 RT-PCR扩增

下游引物2 μL,RNA模板为9 μL,pH值为中性[3]。加热5 min后(加热温度为70 ℃),立即在冰上冷却2 min,收集反应液后,分别加入4 μL 5*first-Strand Buffer、1 μL 0.1 μLMDTT、1 μLRnasin(40 M/μL),42 ℃环境下温浴2 min,之后加入1 μLTiANSCript,放置95 ℃环境下加热5 min,之后冷冻保存。RT-PCR反应循环设置为:共5个周期,每个周期分别是94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,静止后50 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,72 ℃ 5 min,最后将RT-PCR产物放置于4 ℃保存,上游引物体积0.5 μL,下游引物体积0.5 μL,CDNA模板体积为2.00 μL,无 RNA酶水体积为9.5 μL。

2.2.2 PCR纯化回收

取扩增产物于1%琼浆糖凝胶进行电泳鉴定[4]。参照DNA凝胶回收试剂盒说明书,取DNA目的条带,称取所切下凝胶重量,放置于清洁EP管中,加入100 μLBinding Buffer加入0.1 g凝胶,水浴10 min,水温55 ℃,每3 min上下颠倒1次,保证溶液完全溶解。将溶解后溶液利用高速离心机,加入吸附柱后离心1 min,12 000 r/min,之后加入300 μLBinding Buffer,使用高速离心机离心1 min,12 000 r/min,之后加入700 μLBinding Buffer,使用高速离心机离心时间1 min,10 000 r/min,重复1次后收取管中液体,将吸附柱放入新的EP管中,置于-20 ℃低温保存,加入30 μLBinding Buffer,静止3 min后离心1 min,10 000 r/min。

2.2.3 质粒DNA提取

取纯化后菌液,利用高速离心机离心2 min,10 000 r/min,留取沉淀,之后加入250 μL solutionⅠ、250 μL solution Ⅱ、350 μL solution Ⅲ,上下翻转6～8次,之后温和颠倒混匀,滞留2 min左右,离心10 min,10 000 r/min,将上清液至于吸附柱中,离心1 min,10 000 r/min,除去液体,加入500 μL DNA Wash Buffer,离心1 min,10 000 r/min,弃去液体,加入50 μL缓冲液,离心2 min,12 000 r/min,剩余液体即为重组质粒DNA。

2.3 结果

PCR产物经过琼脂糖电泳可得到增片段,大小为405 bp,且标准毒株通过扩增也得到同样大小条带,之后分析特异性条带,可发现每个泳道是否存在明显的特异性扩增,以此判断阳性病例。在本次试验中,共收集6份疑似病例病料,通过以上RT-PCR检测方法,以各毒株反转录产物为模板,结合1%琼脂糖凝胶电泳,扩增出了l条电泳带,电泳带条大小与预测结果一致,非鸡传染性支气管炎病毒则没有扩增出条,将尿囊液上清作连续10倍稀释,板量为5×102～5×103EID50/mL,每条条带大小均为405 bp,并得出电泳条带(由明到暗呈梯度依次递减),其中有2份病料条带呈现特异性扩增(阳性)。

3 讨论

鸡传染性支气管炎是肉鸡养殖管理工作中常见疾病之一,由鸡传染性支气管炎病毒引起[5]。该病毒是冠状病毒科的一个代表种,表面有杆状纤突,有囊膜,为单股DNA,且该类病毒病原性较为复杂,有众多血清型,同时变异株较。近年来各兽医专家学者依据鸡传染性支气管炎发病症状和临床表现的不同,将毒株分离为3种形态,最终将鸡传染性支气管炎划分出3种病症类型,分别是肾型、腺胃型和呼吸型。

在鸡传染性支气管炎实验室诊断方法中,如血清学实验检测方法,虽然该类方法操作简单,但是存在特异性不强、检测敏感性低、检测周期长等弊端,难以满足大规模养殖场病鸡集中检测时效性要求。因此建立快速特异的诊断方法尤为重要,RT-PCR方法就是其中之一,该类方法特异敏感性更强,灵敏、快速、精准,是近年来临床检测和诊断中的常见技术,本次试验研究利用RT-PCR方法,通过基因分子生物学信息,设计特异性引物,之后扩增出目的条带,分析条带特异性,之后通过基因判断,可测定病料扩增阴阳性,为临床诊断提供可靠的技术支撑,时效更快,精准程度更高。

基层畜牧兽医技术人员和相关部门应该及时对疑似病例进行诊断,利用生物分子检测技术,开展流行病学调查,分析养殖场所内鸡传染性支气管炎感染现状,以此为后续防控和治疗工作提供科学依据。