lncRNA H19 在多囊卵巢综合征患者的表达及与多囊卵巢综合征患病风险的相关性*

孙秀红, 李小芬, 万均辉, 王红英△

广州市妇女儿童医疗中心 1超声科, 2妇科(广东广州 510623)

目前研究认为，多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是环境因素和遗传易感性共同作用的一种复杂性疾病，遗传因素在其发病机制和预后评价中也发挥着重要作用[1]。长链非编码RNA(long non coding RNA, lncRNA)也是一类小型RNA分子，一般转录本长度>200个核苷酸，lncRNA相对微小RNA(microRNA, miRNA)较长，包含的信息量更多，功能更多样复杂[2]，近年来备受研究者青睐。H19位于人类染色体11p15.5，全长2.3 kb，是最早发现的lncRNA，它不编码蛋白质，通过表观遗传学机制参与基因的调控。H19在胚胎期主要表达于中胚层和内胚层来源的组织，出生后则主要在心肌、骨骼肌、乳腺、子宫、卵巢和睾丸中表达[3]。研究表明H19在女性生殖系统相关疾病如卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、复发性流产[4-9]等中发挥着重要作用。鉴于以上研究结果，结合PCOS的主要病理特点，即高雄激素、高胰岛素血症或胰岛素抵抗，提出以下假设：PCOS中是否也存在H19的表达异常？H19是否与PCOS的临床特征如胰岛素和雄激素代谢紊乱相关？本研究针对上述假设进行部分验证。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年6月至2020年6月就诊于广州市妇女儿童医疗中心首次确诊为PCOS的患者20例作为病例组，PCOS的诊断标准采用鹿特丹欧洲人类生殖与胚胎学会/美国生殖医学学会标准(2003)。选取同期入院就诊因男方无精或弱精症拟行人工授精的正常育龄期妇女20例作为对照组，两组年龄(岁)均衡可比(29.50±3.7vs.31.70±4.5,P>0.05)。所有研究对象在采血前的3个月内均无服用过干扰血清激素水平的药物，无吸烟史。本研究通过了医院医学伦理委员会的审批(穗妇儿 科伦 通字[2021]第322B00号)，所有研究对象签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 基本信息的采集和基础数据的测量 采集包括姓名、年龄、月经婚育史、既往病史、家族及遗传病史等基本信息填入患者基本信息表格。由经过统一培训的研究人员使用相同的测量仪器来测量研究对象的身高和体重。根据体质指数(BMI)的计算公式：BMI=体重(kg)/身高(m)2，计算BMI。

1.2.2 血样采集及相关检测 病例组和对照组均于月经周期的第2～5天，空腹至少8 h后来院采集血样。所有受试者需完成相关内分泌代谢指标测量：采用免疫化学发光法检测血清激素，包括睾酮(T)、孕酮(P)、雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)；采用葡萄糖氧化酶法检测空腹葡萄糖(FPG)与空腹胰岛素(FINS)；采用酶联免疫吸附法检测抗苗勒管素(AMH)和抑制素B(INHB)。胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)的计算公式如下：HOMA-IR=FINS(μIu/mL)×FPG (mmol/L)/22.5。我们采用的胰岛素抵抗判定标准(cut-off值)采用文献报道的HOMA-IR>2.69[10]。

1.2.3 外周血白细胞的分离、总RNA的提取 将EDTA管中的血样加入等体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释约5 mL，采用Ficoll-Paque密度梯度离心方法分离白细胞，将每个样品在4℃下以800g离心30 min。 离心后，获得含有单核细胞的中间层，用PBS洗涤2次以除去Ficoll和血浆。将样品储存在-80℃下以等待进一步的实验。按RNAISO PLUS(大连Takara公司，日本)的说明书进行外周血白细胞总RNA的提取。

1.2.4 H19逆转录与PCR反应 在NCBI网站上的GeneBank数据库中检索H19基因和GAPDH的基因序列。利用primer 5.0软件设计引物，交由广州维伯鑫生物公司合成，其序列见表1。使用Bio-Rad公司的Thermal Cycler DiceTMReal Time System Ⅱ 扩增仪和Takara公司的SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒分别进行定量PCR反应。

表1 引物名称和引物序列

1.3 统计学方法 使用SPSS 17.0统计软件，PCOS患者和对照组数据，正态分布的连续变量使用t检验；非正态分布的数据采用Mann-WhitneyU检验。根据我们的实验结果，按照H19的表达水平将实验组分成2个亚组：H19水平<0.170 6定义为低表达组，而H19水平≥0.170 6定义为高表达组。计算Pearson或Spearman相关系数评估H19的表达量和患者临床或生化数据之间的相关性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例组和对照组血清学临床指标比较 与对照组相比，病例组的BMI、T、LH、LH/FSH、AMH、FINS、FPG、HOMA-IR水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。两组之间年龄、FSH、E2、P、INHB水平则差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 PCOS患者和对照组的血清学临床数据对照表

2.2 H19在外周血白细胞中的表达水平 病例组外周血白细胞中H19表达水平(1.59±0.30)，显著高于对照组(0.17±0.02),差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 H19在两组外周血白细胞中的表达(经2-ΔΔCt转换后)

2.3 lncRNA H19表达水平和PCOS患病风险的相关性 根据对照组外周血白细胞中的H19的表达水平，对正态分布的数据计算平均数作为截断值，为0.170 6，即H19表达量>0.170 6为高表达，反之为低表达。据此把病例组和对照组女性各分成2个亚组。病例组：低表达1例，高表达19例；对照组：低表达15例，高表达5例。通过logistic 回归模型分析发现外周血白细胞高表达H19的个体患PCOS的风险更高，见表3。

表3 外周血白细胞中H19的表达高低和PCOS患病的风险

2.4 外周血白细胞中H19的表达和临床数据的相关性 把H19的表达量作为因变量，各血清学临床数据作为自变量，发现H19的表达和各血清学临床指标之间无明显相关性。见表4。

3 讨论

PCOS具有高度异质性，体现在其临床表现复杂多样，实验室检查及其他辅助检查差异很大，但其主要特点鲜明[11]。其主要特点为高雄激素、高胰岛素血症或胰岛素抵抗、卵巢多囊样声像改变。PCOS不能被治愈，随着时间推移病程进行性发展。近年来，我们课题组从遗传学角度进一步探究PCOS的发病机制，寻求诊疗新角度。本研究中我们检测了PCOS患者外周血白细胞中 H19 的表达量，评估了H19 与 PCOS 之间关联。我们的实验结果显示PCOS女性的 H19 表达水平显着高于健康对照组，H19 表达水平高的女性罹患PCOS的风险显着高于表达水平较低的女性。这些结果提示 H19 可能部分参与了PCOS的发生和发展。

表4 H19的表达和临床数据的相关性

H19 已被证明在一系列疾病的发展中起着关键作用，H19 涉及一系列广泛的生理和病理过程，包括基因转录、RNA 代谢、表观遗传学修饰和肿瘤的发展等，既往关于H19的研究多集中在生长发育、糖代谢和肿瘤转移等方面[12-14]。Sanchez-Parra等[15]证明H19 在胰岛中的表达下调，可能是胰岛功能紊乱和超微结构受损的潜在机制。Ozgur等[16]研究表明，H19 与雄激素依赖性神经内分泌前列腺癌的发病有关，在前列腺癌细胞系中转染H19 siRNA后，细胞生长和糖代谢能力均显著下降，H19 在调节雄激素水平和糖代谢中发挥作用。以上研究结果说明H19与胰岛素代谢和雄激素高表达相关。且现有研究表明H19在生殖系统相关疾病如卵巢癌[17-18]、子宫内膜癌[19-20])、复发性流产[21]等疾病中也发挥了重要作用。结合本实验结果，我们发现与对照组相比， PCOS 患者外周血白细胞中H19 表达的显著上调，与之前学者的研究结论一致[22]。最新的一项研究利用PCOS患者的血清样本和卵丘细胞，均证实PCOS患者循环和卵巢局部H19水平较对照组显著升高[23]。根据我们的结果，H19表达量的高低似乎与PCOS患病风险相关，即H19 高表达个体相对于低表达个体具有更高的疾病风险，低表达H19的个体患PCOS的风险则相对更低。目前H19 表达的组织特异性已被作为一些疾病如胃癌、乳腺癌[12]的潜在遗传生物标志物，血清或卵丘细胞中H19表达量是否可作为PCOS的生物遗传标记物值得进一步研究。然而，结合我们的实验结果，并不是所有的PCOS患者血清H19水平均高于对照组，PCOS合并H19低表达与PCOS合并H19高表达是由何种内在机制引起的也值得我们进一步探讨。

我们继续分析了PCOS患者高表达的H19与各项临床指标之间的相关性，结果显示H19的表达量和临床指标无显著相关性(r<0.5，P>0.05)。因此，无法根据H19水平推测PCOS患者是否具有高雄激素血症、胰岛素抵抗等临床特点。结合我们的结果，我们认为H19与PCOS高雄激素血症、胰岛素抵抗之间未显示明显的相关性，似乎并不能反映PCOS的严重程度，也无法通过H19来推测PCOS的临床表型。这与之前我们课题组成员的研究结论并不完全一致，之前课题组成员Qin等[22]认为PCOS组高表达的H19与空腹血糖值(FPG)呈正相关，并在一定程度上反映了PCOS患者的代谢水平。Chen等[23]制作了H19基因敲除小鼠，检测卵巢组织中的Cyp17水平和血清睾酮水平，发现H19的缺失可能通过Cyp17介导的机制破坏雄激素的产生，据此推测过量的H19可能与PCOS高雄激素血症相关。这些在我们的结果中均未得以验证，可能本实验样本量有限且实验设计之初并没有根据PCOS患者不同的临床表型进行亚分类，造成实验结果和结论都有所偏倚。

同时，H19基因和人胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor-2，IGF2)基因作为经典的交互印记基因，目前诸多研究证明其在生殖发育及生殖领域相关疾病中也发挥着重要作用[24]。IGF2和H19基因均位于人类染色体11p15.5，两者定位相近，距离仅70 kb，交互印记，拥有同一调控系统，共同调控着人体的生长发育。IGF2是母源性印记基因，父方表达，IGF2是胚胎性生长因子，是一种分泌的小蛋白质，可促进多种细胞的增殖和分化。而H19基因属于父源性印记基因，母源表达，只在mRNA水平发挥调控作用，最终产物是内源性交互印迹基因RNA，不能表达成蛋白质，H19基因作为一种生长调控基因，在细胞增殖和分化中具有双重作用[25]。然而，H19/IGF2这一组交互印记基因在PCOS的发生、发展中的作用机制目前研究甚少。PCOS是否存在H19/IGF2交互印记的异常，其印记异常是否是PCOS胰岛素和雄激素代谢异常的关键所在，这些值得我们继续深入探讨。

综上所述，我们的研究确定了PCOS患者外周血白细胞中H19的呈高表达水平，但H19的表达量与各临床指标无显著相关性，虽然部分实验结果与现有报道并不完全符合，但H19 可能至少部分的参与并促进了 PCOS 的发生和发展。本研究存在局限性。首先，外周血标本易于收集，可反映机体的整体状态，但同时复杂的血液背景使得难以识别PCOS患者外周血样本中lncRNA的细胞起源和组织表达模式，亦不能准确反映卵巢局部的内分泌状况及卵泡发育情况。其次，样本量小，仅包含20例PCOS患者和20例正常对照。虽然我们的研究只是小样本的PCOS患者与 H19 表达相关的数据，但我们的研究提供对了从表观遗传学角度认识PCOS的新角度和新见解。

利益相关声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献说明：孙秀红负责设计实验、采集分析数据及论文撰写；李小芬、万钧辉参与数据整理和统计分析；王红英审阅和修订论文。