结直肠癌中错配修复蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6和Ki-67表达的意义及与预后的关系*

徐燕, 雷俊平, 尚松, 蔺兵虎△

1锦州医科大学湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院研究生联合培养基地普外科(湖北襄阳 441000)； 2襄阳市第一人民医院普外Ⅲ科(湖北襄阳 441000)

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是指结直肠上皮来源的癌症，在美国癌症协会公布的最新一期的《2021年度癌症统计报告》[1]中，结直肠癌的发病率及病死率均位于第三，随着早癌筛查的普及，病死率有所下降，结直肠癌经确诊后主要治疗方案为手术切除及辅助放化疗[2]，但结直肠癌的预后评估手段仍不足。在临床中肿瘤分期、病理分型、脉管癌栓侵袭等多方面都证实与结直肠癌患者的预后有关[3]，但这些因素不足以准确地为临床预后进行危险分层；据相关研究表明，微卫星不稳定性(MSI)是肿瘤发生的重要途径[4]，其中错配修复蛋白的表达与否是决定微卫星是否稳定的重要因素，即错配修复蛋白表达的缺失可导致正常细胞的异常增殖或肿瘤发生；在细胞增殖周期中，除了静止(G0)期，其余时期(比如G1期、S期、G2期和分裂期)Ki-67均有表达[5]，所以在各个肿瘤的研究中，Ki-67可以被用于评估肿瘤的恶性程度和预后情况，也可以作为预测肿瘤是否发生转移的指标[6]。本研究对切除的结直肠癌组织标本进行免疫组化检查，观察4种错配修复蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2及Ki-67在结直肠癌中的表达情况，分析其与肿瘤的临床病理特征和预后之间的关系，为结直肠癌的临床诊疗和预后评估提供一定的参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年1月1日至2019年12月31日在普外Ⅲ科行手术治疗后病理确诊为结直肠癌患者的临床数据，总纳入病例231例，排除18例不符合纳入标准病例[9例失访、8例术前行新辅助化疗、1例意外死亡(烧伤)],最终有213例符合纳入标准。每例病理标本都由两位资历较深的病理医师共同阅片。纳入研究的所有患者在接受手术治疗前均未发现有远处转移及未行放化疗，术后均按照结直肠癌的诊疗规范行规律化疗。213例中男131例，女82例，年龄27～92岁，平均63.7岁，左半结肠癌60例，右半结肠癌40例，直肠癌113例，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分别占47例、69例、97例，116例存在淋巴结转移，每半年对参与研究的213例患者进行随访，收集患者复查资料，判断患者经手术治疗后的预后情况，即有无复发及远处转移。本研究已经通过我院医学伦理委员会的认可(XYYYE20220055)。

1.2 纳入标准及排除标准 纳入标准：(1)有完整的临床资料；(2)经病理检查确诊为结直肠癌；(3)经手术切除原发病灶者；(4)定期随访者。

排除标准：(1)术前已经实行放化疗者；(2)有其他原发恶性肿瘤病史；(3)有复发或无法彻底切除的晚期病变的患者；(4)失访者。

参与本研究的所有研究对象均已经取得同意并签署同意书。

1.3 方法 回顾性分析符合纳入标准的213例患者的临床资料，总结其病理特征，根据免疫组化的结果(图1)将错配修复蛋白及Ki-67进行分组，错配修复蛋白(MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)分组依据：4种错配修复蛋白均不存在缺失分为错配修复蛋白正常组，一种及一种以上错配修复蛋白存在缺失分为错配修复蛋白缺失组；Ki-67分组依据：经过阅读中外文献后将Ki-67分为低表达组(Ki-67<25%)、高表达组(Ki-67≥25%)；在性别、年龄、肿瘤侵及范围、肿瘤分期、病理分型、是否有淋巴结转移、术后复发率等多方面分析两者之间有无相关性，定期随访患者术后身体恢复及有无复发及转移情况。

1.4 观察指标 分析免疫组化结果，观察结直肠癌患者的4种错配修复蛋白和Ki-67的表达情况，首先分别比较4种错配修复蛋白和Ki-67的表达与结直肠癌临床特征及预后情况的关系，再比较不同情况下的结直肠癌中错配修复蛋白与Ki-67表达两者之间的相关性。

1.5 随访 通过使用电话、门诊检查、住院复查等多种方式对参与本研究的患者进行随访，根据患者的影像学表现、细胞学和病理学检查、抽血检查结果等多方面，综合评价患者愈后情况。

1.6 统计学方法 使用SPSS 26.0统计软件、Excel处理收集到的数据，计量资料以均数±标准差表示；计数资料由百分比(%)表示；组内参数间比较采用独立样本2检验；参数之间的相关性采用Pearson相关分析；使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，所有检验均为双侧；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌中4种错配修复蛋白和Ki-67表达的结果分析 根据213例病理组织的免疫组化检测结果，MSI的概率为19.2%，其中4种错配修复蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6缺失率分别11.7%、12.2%、6.6%、6.1%，Ki-67的低表达率和高表达率分别为63.8%、36.2%。其中MLH1、PMS2均缺失有17例，MSH2、MSH6均缺失有7例，4种错配修复蛋白均缺失的有2例。见图1。

注：A：MLH(+)；B：MLH(-)；C：PMS2(+)；D：PMS2(-)；E：MSH2(+)；F：MSH2(-)；G：MSH6(+)；H：MSH6(+)；I：Ki-67低表达；J：Ki-67高表达

2.2 4种错配修复蛋白和Ki-67表达与结直肠癌的临床指标和病理特征的关系 经分析，MLH1、PMS2和肿瘤发生的病变部位有关(P<0.05)，与性别、年龄、病理分型、解剖分期、侵及范围、淋巴结转移、脉管和神经侵犯均无关(P>0.05)，Ki-67与肿瘤发生的病变部位、脉管内侵犯有关(P<0.05)，与性别、年龄、病理分型、解剖分期、侵及范围、淋巴结转移、神经侵犯均无关(P>0.05)。见表1。

表1 4种错配修复蛋白及Ki-67的表达与结直肠癌临床病理特征的关系 例

2.3 4种错配修复蛋白和Ki-67表达的相关性 MLH1与PMS2表达有相关性(r=0.800，P<0.01)，MSH2与MSH6表达有相关性(r=0.724，P<0.01)，Ⅰ期的结直肠癌和未突破固有肌层的结直肠癌中Ki-67与MSH6有相关性(r分别为-0.401、-0.340，P<0.01)；男性的结直肠癌中Ki-67与MLH1有相关性(r=0.189，P<0.05)。见表2～4。

表2 MLH1与PMS2、MSH2与MSH6的相关性

表3 Ki-67与MSH6的相关性

表4 性别为男性时Ki-67与MLH1的相关性

2.4 MSI和Ki-67的表达对结直肠癌患者预后的影响 213例患者中，Ki-67及MSI表达情况与结直肠癌患者预后有相关性(r分别为0.150、0.156，P<0.05)，Ki-67低表达、微卫星不稳定的患者无病进展生存率较Ki-67高表达、微卫星稳定的高。见图2。

注：A：Ki-67的表达与CRC患者无疾病生存进展期的关系；B:MSI与CRC患者无疾病生存进展期的关系

3 讨论

结直肠癌的发生是一段由息肉转变为腺瘤，腺瘤转变为癌症的过程[7]，此过程时间较长，且肿瘤发生早期症状不明显，随着肿瘤发展而逐渐表现出排便习惯改变、便血等症状。经过长时间的研究与分析，结直肠癌的发生大多与遗传因素、生活方式等多方面有关系，其中遗传方面的因素主要包括染色体的不稳定性和MSI[8]；错配修复蛋白包括MutS(MSH2、MSH3、MSH6)和MutL(MLH1、MLH3、PMS1、PMS2)两大家族，其中MLH1、PMS2、MSH2、MSH6是错配修复基因的主导蛋白[9-10]。错配修复蛋白表达缺失可致MSI，而MSI与结直肠癌的发生密切相关[11]；林奇综合征又称为遗传性非息肉性结直肠癌，约占结直肠癌的3%～5%，是由4种错配修复基因突变引起的一种常染色体显性遗传易感性疾病[12]，当患者免疫组化结果显示为MSH2、MSH6共同缺失时，有最强烈的林奇综合征相关肿瘤家族史[13-14]。本研究结果显示，MSI与肿瘤发生的病变部位、病理分型有关，与性别、年龄、解剖分期、侵及范围、淋巴结转移、神经侵犯均无关；其中MLH1、PMS2共同缺失和MSH2、MSH6共同缺失分别占比为7.9%、3.2%，MLH1、PMS2、MSH2、MSH6的表达呈正相关(r=0.800、r=0.724，P<0.01)，这与Hall等[15]研究结论一致；错配修复蛋白的缺失多见于中年、性别为男性、发生于右半结肠、处于Ⅱ期状态、肿瘤突破固有肌层、有脉管内癌栓侵犯、有淋巴结转移的结直肠癌患者，这与国内外大部分研究结果一致[7, 14, 16-17]，但是Liang等[8]的研究结论为女性患者中错配修复蛋白缺失状态更多见，在性别方面错配修复蛋白表达对结直肠癌的影响存在差异是因为种族差异、队列规模较小，还是确实存在性别优势导致，这需要进一步大样本研究。

Ki-67是一种核蛋白，与RNA转录及细胞增殖相关[18]，可反映细胞分裂增殖程度，该蛋白在细胞分裂增殖活跃阶段(G1期、S期、G2期和分裂期)表达水平较高，但在静止期细胞(G0期)中缺失，这个特点可用于标记处于增殖状态的细胞，所以Ki-67蛋白的过度表达可能表明细胞正常的增殖机制遭到破坏，导致肿瘤的发生[19]；许多研究表明，Ki-67蛋白的表达在各种恶性肿瘤中有预测作用，包括乳腺癌、胃肠道间质瘤、胃肠道神经内分泌瘤等[20]，该蛋白在肿瘤组织中的表达明显高于癌旁组织，术前接受过放化疗患者的肿瘤组织中检测到Ki-67蛋白表达相对更低；多项研究发现，Ki-67蛋白的表达在结直肠癌中存在临床意义，可作为结直肠癌独立预后的生物标志物，但意见不一，多项研究结果表明[21-23]，与Ki-67蛋白低表达患者相比，Ki-67蛋白高表达患者的无病生存期较短且复发或远处转移概率较大，对患者的预后是一个不利因素；但在其他研究中[24-25]，与Ki-67蛋白低表达患者相比，Ki-67蛋白高表达患者降低了肿瘤的复发率、提高了生存率, 对患者的预后是一个有利因素；在本研究中，Ki-67和肿瘤发生的病变部位、脉管内侵犯有关，与性别、年龄、病理分型、解剖分期、侵及范围、淋巴结转移、神经侵犯均无关，Ki-67蛋白高表达患者的肿瘤复发及转移率较高；此外在诸多研究中，Ki-67蛋白表达对结直肠癌预后方面的影响存在差异，可能是因为国际上并未对结直肠癌中的Ki-67蛋白表达分组临界值作详细规定，不同研究出现的不同结果可能是由于所采取的分界值不同而产生的。

经分析，本研究发现在Ⅰ期的结直肠癌和未突破固有肌层的结直肠癌中Ki-67与MSH6有负相关性，即MSH6表达缺失时Ki-67蛋白为低表达，其结直肠癌患者的肿瘤复发及转移率低，在男性的结直肠癌中，Ki-67与MLH1呈正相关，即MLH1表达缺失时Ki-67蛋白为高表达，进而导致患者的肿瘤复发率及转移率高。本研究局限性及待解决问题：样本量不大，后续应加大样本量；随访时间较短，后续应长期随访符合纳入标准的病例，做进一步分析。

综上所述，4种错配修复蛋白和Ki-67的表达在结直肠癌中存在临床意义，且在Ⅰ期、未突破固有肌层、性别为男性的结直肠癌患者中两者之间存在相关性，表明联合检测错配修复蛋白和Ki-67可以提高结直肠癌的诊断及预后评价的准确性，在临床上可以为其提供一定的指导意义。

利益相关声明：本文作者声明不存任何利益冲突。

作者贡献说明：徐燕：设计及实施研究，收集及分析数据，论文撰写及修改；雷俊平：提供研究思路，临床资料收集；尚松：课题经费支持，分析实验数据；蔺兵虎：设计研究方案，论文审核；所有作者都已阅读并批准了论文的内容。