塞来昔布联合莫西沙星对肺炎克雷伯杆菌肺炎大鼠肺部炎症标志物及组织病理学的影响*

曾量波, 钟智成, 刘桂红, 梁庆△, 汪友平

1广州医科大学附属第一医院急诊科(广东广州 510120)； 2广州医科大学附属第三医院妇产科研究所实验部(广东广州 510150)

社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)是引起脓毒症的最常见原因[1-2]，在其发病过程中存在过度的炎症反应与宿主的抗炎机制失去平衡，导致多脏器功能障碍。各国研究者寻找在抗生素基础上的抗炎药物，包括糖皮质激素、他汀类、磷酸二酯酶抑制剂等以抑制或调节过度激活的炎症反应，减轻炎症介导的肺损伤及其他器官损害以降低重症社区获得性肺炎的病死率，但仅糖皮质激素被推荐有条件下应用[3]。研究表明环氧化酶-2(COX-2)与各种肺部疾病有密切关系，在肺炎动物模型和人类肺炎均明显表达[4-5]。在抗生素基础上加用特异性COX-2抑制剂能否通过调节炎症平衡，减轻肺部损伤，进而提高存活率尚未明确，目前国内鲜见类似研究的报道。肺炎克雷伯杆菌是重症社区获得性肺炎最常见的致病菌之一[6]。2019年3—12月，本研究探讨了特异性COX-2抑制剂塞来昔布联合莫西沙星对肺炎克雷伯杆菌肺炎大鼠肺部炎症标志物及肺组织病理学的影响，可为临床在抗生素治疗基础上，寻找新的治疗途径有效调节炎症反应以改善重症肺炎预后提供实验依据。本动物实验获得广州医科大学附属第一医院医学伦理会的批准。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SPF级雄性SD大鼠60只，由广东省医学实验动物中心提供[实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2016-0168，实验动物使用质量合格证：SCXK(粤)2013-0034]，鼠龄为6～8周，体重180～200 g。

1.1.2 病原 肺炎克雷伯杆菌标准株，由本院检验科细菌室提供，制备浓度为4个麦氏浊度单位的细菌悬液[7]。

1.1.3 药物 根据人和大鼠间按体表面积折算的等效剂量比值0.018进行计算，特异性COX-2抑制剂塞来昔布(Celebrex，美国辉瑞公司)，按20 mg/(kg·d)，溶于20 mL二甲基亚砜(DMSO)；抗生素莫西沙星(Moxifloxacin，拜耳医药保健有限公司)，按42 mg/(kg·d)，溶于20 mL DMSO。

1.1.4 试剂盒 大鼠C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10、转化生长因子(TGF)-β、热休克蛋白90(HSP90)、血栓素A2(TXA2)、前列腺素I2(PGI2)、前列腺素E2(PGE2)的ELISA检测试剂盒，均购自深圳市博卡生物技术有限公司。

1.1.5 实验室 所有动物实验在呼吸疾病国家重点实验室的感染实验室完成。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 根据参考文献[7]，将手术切开皮肤暴露气管穿刺插管改为直视下气管插管，在吸气相将静脉留置针套管插入气道。经气道注入含菌量为4个麦氏浊度单位的细菌混悬液0.35 mL，对照组以相同方法注入等量的无菌生理盐水。建模成功标准根据肺组织病理出现典型的渗出、出血、坏死等肺炎病理表现。

1.2.2 分组 按2、4、6 d 3种给药疗程，每个疗程20只大鼠，各疗程大鼠按随机数字表法随机分为5组，每组4只：空白对照组(control组)、模型组(model组)、COX-2抑制剂塞来昔布治疗组(Cox组)：注射细菌混悬液后次日腹腔注射塞来昔布，1次/d，分别连续注射2、4、6 d；莫西沙星组(Mox组)：注射细菌混悬液后次日腹腔注射莫西沙星，1次/d，分别连续注射2、4、6 d；塞来昔布+莫西沙星组(Cox+Mox组)：注射细菌混悬液后次日腹腔注射塞来昔布及莫西沙星，1次/d，分别连续注射2、4、6 d。3种给药疗程大鼠分别于结束给药后次日，即第3、5、7天分批处死动物。

1.3 观察检测指标

1.3.1 一般情况 (1)行为变化；(2)术前3 d及术后每天体重变化。

1.3.2 血细胞分析及CRP测定 腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后开胸暴露心脏，以5 mL注射器穿刺左心室取血2 mL，使用动物用血细胞分析仪作血细胞分析，ELISA法测定CRP水平。

1.3.3 肺组织病理 完整取下双侧肺组织，观察肺组织大体变化情况，称双肺湿重，计算肺湿重与体重(L/W)的比值。切取右肺各叶，放入-80℃冰箱待检测。留取左肺于4%甲醛溶液充分固定24 h后，苏木精-伊红(HE)染色后，病理显微镜下观察组织变化。

1.3.4 肺组织炎症标志物的测定 取出冰冻肺组织按照试剂盒说明制成肺组织匀浆上清液，ELISA法测定：(1)致炎作用的细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β及抗炎作用的细胞因子IL-10、TGF-β水平；(2)环氧化酶代谢产物TXA2、PGI2、PGE2水平；(3)HSP90水平。

2 结果

2.1 一般情况与肺L/W比值

2.1.1 一般情况 造模后当天model组和各药物干预组大鼠活动减弱，蜷缩于鼠笼一侧，偶见竖毛，呼吸急促，双侧胸廓呼吸活动度增强，无发绀，体重无明显下降。造模后次日model组及各治疗组大鼠逐渐出现精神萎靡，毛发失去光泽变稀疏，活动减少，易受惊扰，体重逐渐减轻。

2.1.2 肺L/W的比值 3种给药疗程的各model组L/W均较control组升高(P<0.05)。4 d与6 d的Cox组与Mox组均较control组升高(P<0.05)。3种给药疗程的各Cox+Mox组与control组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但均较model组降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组不同时间L/W的比较

2.2 各种炎症标记物测定

2.2.1 各药物干预组的外周血细胞及CRP的变化 各组血细胞分析显示白细胞、血红蛋白及血小板总数均差异无统计学意义(P>0.05)。见表2～4。2 d和4 d的model组与3个药物干预组CRP均较control组升高(P<0.05)；6 d只有model组与Mox组较control组升高(P<0.05)；4 d和6 d的Cox组、Mox组及Cox+Mox组均较model组降低(P<0.05)。见表5。

表2 塞来昔布及莫西沙星对大鼠外周血白细胞的影响

表3 塞来昔布及莫西沙星对大鼠外周血血红蛋白的影响

表4 塞来昔布及莫西沙星对大鼠外周血血小板的影响

表5 塞来昔布及莫西沙星对大鼠CRP水平的影响

2.2.2 塞来昔布及莫西沙星对肺组织炎症标志物水平的影响

2.2.2.1 对炎症因子的影响 2 d各药物组的细胞因子组间差异无统计学意义(P>0.05)。4 d的model组、Mox组、Cox+Mox组的TNF-α、IL-6、 IL-1β、TGF-β均较control组升高(P<0.05)；Cox组、Mox组、Cox+Mox组的TNF-α、IL-6、 IL-1β、TGF-β均较model组下降(P<0.05)。6 d的model组的TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β均较control组明显升高(P<0.05)；Cox组、Mox组、Cox+Mox组的TNF-α、TGF-β均较model组下降(P<0.05)；Mox组的IL-6较model组下降(P<0.05)；Cox组、Cox+Mox组的IL-1β较model组下降(P<0.05)。见表6～9。

表6 塞来昔布及莫西沙星对大鼠肺部组织TNF-α的影响

表7 塞来昔布及莫西沙星对大鼠肺部组织IL-6的影响

表8 塞来昔布及莫西沙星对大鼠肺部组织IL-1β的影响

表9 塞来昔布及莫西沙星对大鼠肺部组织TGF-β的影响

2 d各药物组的抗炎细胞因子IL-10均与control组差异无统计学意义(P>0.05)。4 d和6 d的model组较control组明显降低(P<0.05)。4 d的Cox组、Cox+Mox组较model组升高(P<0.05)，而6 d只有Cox+Mox组较model组升高(P<0.05)。见表10。

表10 塞来昔布及莫西沙星对大鼠肺部组织IL-10的影响

2.2.2.2 对花生四烯酸代谢产物的影响 2 d各药物组的PGI2、PGE2、TX-A2均组间差异无统计学意义(P>0.05)。4 d的model组、Mox组、Cox+Mox组的3种代谢产物均较control组升高(P<0.05)，Cox组的PGI2较control组升高(P<0.05)；Cox组、Mox组、Cox+Mox组均较model组下降(P<0.05)。6 d的model组较control组升高(P<0.05)；Cox组、Mox组、Cox+Mox组均较model组下降(P<0.05)；见表11～13。

表11 塞来昔布对大鼠肺部组织PGI2的影响

表12 塞来昔布对大鼠肺部组织PGE2的影响

表13 塞来昔布对大鼠肺部组织TX-A2的影响

2.2.2.3 塞来昔布及莫西沙星对HSP90的影响 2 d各药物组的HSP90组间差异无统计学意义(P>0.05)。4 d的model组、Mox组、Cox+Mox组均较control组升高(P<0.05)；Cox组、Mox组、Cox+Mox组均较model组下降(P<0.05)。6 d的model组较control组明显升高(P<0.05)；Cox组、Mox组、Cox+Mox组均较model组下降(P<0.05)。见表14。

表14 塞来昔布对大鼠肺部组织HSP90水平的的影响

2.3 塞来昔布对肺部组织病理学的影响

2.3.1 大体标本 3种给药疗程的control组肺组织外观淡白色，各model组和药物干预组肺肿胀，弹性差，局部见深红色、结节样病灶。

2.3.2 肺组织病理 3种给药疗程的control组肺泡间隔正常，无或仅见极少量炎症细胞；2 d model组细支气管旁肺泡间隔增宽，间隔内炎症细胞及红细胞渗出；2 d Cox组炎症细胞较model减少，但比control组增多；2 d Cox+Mox组炎症细胞较model组及Mox组减少，但比control组增多。4 d model组肺实变，可见大量淋巴细胞，中性粒细胞；4 d Cox组炎症细胞较model组减少，与control组无差异；4 d Mox组及Cox+Mox组可见单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞，少量中性粒细胞，较model组减少。6 d model组机化物形成，机化性肺炎，少许中性粒细胞；6 d Cox组肺泡间隔内炎症细胞及红细胞渗出较model组减少，无机化物的形成；6 d Mox组及 Cox+Mox组肺泡间隔内炎症细胞及红细胞渗出较model组减少，无机化物的形成。见图1。

3 讨论

非甾体抗炎药(nonsteroidal antinflammatory drugs，NSAIDs)通过抑制环氧化酶(COX)，从而抑制前列腺素的合成而产生解热、抗炎作用，在肺炎的治疗中主要用于缓解肺炎伴随的发热、疼痛症状。国内外指南尚未对NSAIDs在社区获得性肺炎的抗炎方面作出明确建议[8-9]。对过度激活的炎症反应进行调节是目前研究的热点问题，但除激素外对其他药物尚无明显进展。本研究从NSAIDs家族中的特异性COX-2抑制剂塞来昔布联合抗生素莫西沙星对肺部炎症标志物和病理学角度探讨其对减轻肺炎炎症有无协同作用，为临床通过干预COX-2途径对炎症反应进行调节,以减轻肺损伤及改善重症肺炎预后提供实验依据，国内类似研究报道不多。本实验结果显示塞来昔布单独及联合莫西沙星对大鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎肺部炎症因子，前列腺素代谢产物及肺组织病理学均产生影响。

肺炎时局部与全身性炎症因子升高，且与病情有密切关系，而其血清的水平在重症肺炎时明显升高[10]。肺泡灌洗液的IL-6、IL-8和INF-γ的水平均明显升高，但与病情严重性无相关性[11]。本研究显示大鼠肺炎克雷伯肺炎模型肺组织的致炎细胞因子水平明显升高，塞来昔布、莫西沙星单独及两药合用均降低致炎细胞因子水平，但两者联合并未显示优于塞来昔布或莫西沙星单独使用。本研究显示有抗炎作用的细胞因子IL-10随造模时间延长而降低，塞来昔布单独及与莫西沙星合用均提高IL-10水平，提示塞来昔布对改善致炎与抗炎因子的平衡有益。

COX-2主要存在于炎症部位，在外界刺激因子的作用下促使炎症介质前列腺素的合成并引起炎症反应。各种前列腺素代谢产物的作用不一样，TXA2是强有力的血小板聚集物，血管收缩剂，PGI2是血管舒张剂和血小板聚集抑制剂，PGE2具有舒张血管、抗炎和免疫抑制作用。COX-2基因敲除大鼠对铜绿假单胞菌的清除能力增强，认为与COX-2的产物PGE2抑制巨噬细胞产生超氧化物的生成有关[12]。感染类鼻疽伯克菌小鼠迅速诱导巨噬细胞产生PGE2，PGE2有利于细菌在细胞内生长[13]。cAMP是细胞内第二信使，能上调或抑制细胞因子生成，但也有抑制细胞吞噬，吞噬体酸化，溶酶体酶释放等，研究发现抑制前列腺素产物能降低cAMP水平，增强宿主杀菌能力[14]。上述研究提示抑制COX-2影响其代谢产物而增强宿主抗菌能力。本研究显示塞来昔布及与抗生素合用均使前列腺素代谢产物水平降低，可能有利于细菌的清除。

既往有研究显示H7N9感染的重症肺炎小鼠在抗病毒药物基础上加用塞来昔布能减轻肺部炎症，降低病死率[15]。最近也有研究显示低剂量双氯芬酸能使MRSA对β-内酰胺类药物敏感性重新增加，抑制MRSA相关生物膜的形成[16]。新冠病毒肺炎流行期间虽然出现了使用布洛芬可能恶化肺炎病情的争议[17]，但也有学者认为抑制环氧化酶可为COVID-19的辅助治疗提供选择[18]。本研究对肺组织病理观察显示特异性COX-2抑制剂塞来昔布单独或与抗生素合用均有助于减轻肺组织损伤，但塞来昔布与莫西沙星合用在降低部分细胞因子水平及改善肺组织作用未显示出明显优于单独塞来昔布的作用，需要排除塞来昔布与不同抗生素可能存在相互作用，样本量及观察时间不足以及评价指标的局限性等因素的影响。目前尚缺乏特异性COX-2抑制剂与抗生素合用有无协同作用的文献报道。

NSAIDs不能代替抗生素，早期肺炎在没有应用抗生素下单独应用NSAIDs可能对机体免疫功能产生影响[19-22]，但确切机制未明。研究显示小鼠体温升高(38.5℃)及以上时，HSP90快速产生，激活免疫细胞表面的α4整合素，使血液循环中的α4整合素介导的T淋巴细胞高效、快速迁移到淋巴结和炎症感染部位清除病原体[23]。本研究显示肺炎克雷伯杆菌肺炎模型肺组织HSP90水平明显升高，塞来昔布单独及与抗生素合用均使其水平降低。热休克蛋白的重要生理作用是参与免疫应答，早期单独应用COX抑制剂降低HSP90是否影响T淋巴细胞的迁移与清除病原体能力有待深入研究。

本研究的不足之处是未检测外周循环两类细胞因子及其他炎症标志物的水平，未进行肺组织菌落记数以评价肺清除细菌能力。另外，塞来昔布与抗生素合用有没有协同作用还需要更多实验评价。特异性COX-2抑制剂在肺炎早期减轻机体炎症反应的同时对细胞免疫功能有无影响及其机制也需要今后进一步研究。

综上所述，本研究显示特异性COX-2抑制剂塞来昔布可降低大鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β等致炎细胞因子和TXA2、PGI2、PGE2等前列腺素代谢产物水平，提高抗炎因子IL-10水平，减轻肺组织炎症细胞浸润、肺泡间质出血；与单用塞来昔布及莫西沙星相比，塞来昔布联合莫西沙星在降低致炎细胞因子水平及改善肺组织病变作用方面并无显著优势。

利益相关声明：所有作者均声明不存在任何利益冲突。

作者贡献说明：曾量波负责实验设计、数据分析、论文撰写；钟智成负责动物实验、数据分析；刘桂红、汪友平负责实验；梁庆负责技术指导。