miR-21靶向E2F1对三阴性乳腺癌细胞恶性生物学活性及裸鼠肿瘤抑制率的影响*

刘起鹏, 张婷, 郭婉莹

河南科技大学第一附属医院乳腺外科(河南洛阳 471003)

乳腺癌是临床女性常见的恶性肿瘤，其发病率占全部恶性肿瘤的10%，且近年来发病率逐渐上升，对女性的生命健康造成严重的威胁[1]。近年来，临床常采用手术、放化疗等多种方法治疗乳腺癌疾病，治疗疗效得到明显提升且被临床证实[2]。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌的分子类型之一，其发病率约占乳腺癌的20%左右，与乳腺癌治疗手段相比，TNBC治疗手段具有一定局限性，且预后也相对较差[3]。因此，有效治疗TNBC的方法是目前学者们研究的热点。大量研究证实[4]，微小RNA(miRNA)可作为原癌基因或者抑癌基因，参与多种实体肿瘤的发生发展，其中miR-21被学者们广泛关注，其是一种具有自主转录单位的miRNA[5]。文献报道[6]，在多种恶性肿瘤中发现miR-21呈高表达，包括肝癌、肺癌、食管癌等，但其对TNBC的影响鲜有文献报道。人E2F1基因定位于染色体20q11.22，是编码含437个氨基酸的蛋白，其在细胞周期G1-S聚集，表达增高，可促进细胞周期进程[7]。有学者研究发现[8]，在多种恶性肿瘤中E2F1呈高表达，其与肿瘤的发横发展密切相关。有学者研究证实[9]，E2F1在肺癌患者中的转录水平均高于正常组织，且在非小细胞肺癌中起促进生长因子的作用，与侵袭和迁移密切相关。目前有学者发现[10]，E2F1在乳腺癌中水平升高而促进肿瘤进展，但其在三阴性乳腺癌中的作用机制尚不清楚。因此，2021年1月至2022年1月，本研究探究miR-21靶向E2F1对三阴性乳腺癌细胞恶性肿瘤生物学行为及肿瘤抑制率的影响。本研究已经医院伦理审查备案(2022-03-B076)。

1 材料与方法

1.1 细胞系和实验动物 人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231、人正常乳腺上皮细胞MCF10A(中国医学科学院北京协和医院基础研究所)。6周龄BALB/c雌性裸鼠(广西医科大学动物实验中心)，共计10只均为SPF级，体质量14～16 g，饲养在统一的动物房。

1.2 试剂和仪器 miR-21 inhibitor、阴性对照 inhibitor质粒(武汉中帜生物科技有限公司)；E2F1抗体(武汉艾美捷科技有限公司)；siRNA-E2F1、siRNA-NC(广州锐博生物科技公司)；双荧光素酶报告基因载体(北京科展生物科技有限公司)；PCR引物序列(吉林省奇健生物技术有限公司)；低温高速离心机(广州吉迪仪器有限公司)；荧光倒置显微镜(深圳力创仪器有限公司)。

1.3 细胞培养 复苏人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人正常乳腺上皮细胞MCF10A，均接种于6孔板中，分别加入含双抗的DMEM培养基，将培养基置37℃，体积分数为5%CO2的培养箱中培养24 h。更换培养液，2 d 1次，取处于对数期的细胞用于实验。

1.4 细胞分组和转染 根据LipofectamineTM2000试剂盒对细胞进行转染，将MDA-MB-231细胞分为5组，即MDA-MB-231组(MDA-MB-231细胞未转染任何质粒正常培养)；分别将miR-21 inhibitor、阴性对照inhibitor质粒分别转染至MDA-MB-231细胞中，分为miR-21 inhibitor组和miR-NC inhibitor组。将siRNA-E2F1、siRNA-NC分别转染至MDA-MB-231细胞中，分为siRNA-E2F1组和siRNA-NC组。各组细胞均继续培养24 h后进行后续实验。

1.5 qRT-PCR检测细胞中miR-21表达 取所有细胞加入TRIzol裂解液裂解细胞，根据试剂盒中的反转录法操作，得到cDNA模板后进行荧光反应实验，内参为U6。在94℃ 3 min，94℃ 变性40 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，最后72℃下延伸10 min的反应条件下，对miR-21进行扩增。2-ΔΔCT法计算细胞中总miR-21表达。引物序列见表1。

1.6 MTT法检测细胞增殖 在各组细胞中加入0.25%胰蛋白酶消化成细胞悬液，接种细胞于24孔板中，每孔加入3×104个细胞，同时加入培养基600 μL，常规培养箱培养孔板；待细胞生长到50%

表1 引物序列表

融合时，更换孔板内的血清为RPMI 1640培养基培养24 h，后将10%胎牛血清的RPMI 1640培养基加入到细胞中。分别在24、48和72 h时往培养板中加入MTT继续培养4 h弃掉培养基，加入150 μL二甲基亚砜室温孵育10 min，待紫色结晶完全溶解后，检测仪于570 nm处测定吸光度(A)值。

1.7 Transwell小室法检测细胞侵袭能力 消化各组MDA-MB-231细胞至悬液。取Transwell小室，在上室中加入悬液300 μL，下室加入含血清培养基，孵育小室24 h。将小室取出置于甲醛中，25 min后加入结晶紫，让细胞均匀染色。用显微镜观察细胞穿模数量。

1.8 划痕实验检测细胞迁移能力 取MDA-MB-231细胞，胰酶消化细胞，接种MDA-MB-231细胞于6孔板中，当细胞贴壁生长后，更换孔板的培养基，培养48 h后用常规消化MDA-MB-231细胞，将细胞密度调整为5×104个/孔，单层接种至24孔板中，在37 ℃的环境中孵育培养箱，待细胞融合度达80%时弃掉上清液，用20 μL无菌枪头划痕，PBS洗去脱落的细胞。加入无血清培养基继续培养24 h，并于0 h和24 h在倒置显微镜下选定同一位置拍照，分别测量划痕宽度(W0h、W24h)，计算划痕愈合率(%)=(W0h-W24h)/W0h×100%。实验重复3次。

1.9 流式细胞术检测细胞凋亡能力 用96孔板培养MDA-MB-231细胞24 h，加入1× binding buffer，10 μL annexin V和20 μL PI于孔板内，配置annexin V/PI 染色工作液后将原有的培养基全部弃掉。将细胞置于孵育箱中，加入胰蛋白酶裂解细胞，后离心取上清液，孵育15 min后检测凋亡情况。

1.10 蛋白质印记检测细胞中E2F1蛋白表达 取各组细胞，接种细胞于6孔板内，先加入胰蛋白酶和RIPA裂解液，分别消化和裂解细胞，待细胞完全裂解后置于离心机中离心，收集上清液于EP管中，对上清液中的蛋白含量进行测定。配置浓缩胶和分离胶，浓度分别为5%和8%，在胶孔中分别加入样品蛋白，电泳10 min后转膜2 h。将PVDF膜用5%封闭液激活，室温下封闭1 h。加入一抗E2F1和β-actin，于4℃环境孵育细胞过夜；加入HRP标记的二抗继续孵育2 h。用ECL检测细胞PVDF膜并成像。

1.11 双荧光素酶报告靶基因荧光检测 采用StarBase软件(http://starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php? source=mRNA)预测E2F1的3′UTR端与miR-21的结合点位。设计合成野生型序列和突变型序列，分别为E2F1 3′-UTR和E2F1 3′-UTR，将荧光素酶报告基因载体中克隆基因片段，构建E2F1 3′-UTR双荧光素酶报告基因载体(pmir-GLO-wt-E2F1)及其突变型载体(pmir GLO-mut-E2F1)。用LipofectamineTM3000将WT-E2F1、MUT-E2F1分别与miR-NC inhibitor(miR-NC)或miR-21 inhibitor(miR-21)质粒共同转染至MDA-MB-231细胞，48 h后检测其荧光素酶活性。转染分组见表2。

表2 共转染分组

1.12 建立原位移植瘤卵巢癌裸鼠模型 调整miR-NC inhibitor组和miR-21 inhibitor组MDA-MB-231细胞密度为2×107·mL-1，随机取5只大鼠接种miR-NC inhibitor组细胞，剩下5只大鼠接种miR-21 inhibitor组细胞，接种位置为右侧腋下皮下部位，接种量为0.2 mL。于第5天肉眼可见裸鼠接种肿瘤部位有黄豆大小的肿瘤生成。

1.13 肿瘤体积测定 绘制裸鼠原位移植瘤体积生长曲线，横坐标为接种的时间，纵坐标为肿瘤的体积。测定2组裸鼠肿瘤体积变化，测定肿瘤的最长直径(D)和最短直径(d)，计算各组裸鼠肿瘤体积(V)变化。V=-D×d2×0.5(D、d单位mm)。当测定发现移植瘤体积生长至500 mm3时处死裸鼠，将各组裸鼠的移植瘤剥离，取出后用生理盐水冲洗，拍照。肿瘤组织拍照后，称取肿瘤质量。

2 结果

2.1 细胞中miR-21表达比较 MDA-MB-231细胞中miR-21 表达明显高于MCF10A细胞(P<0.05)。MDA-MB-231组细胞中miR-21表达和miR-NC inhibitor组细胞相比差异无统计学意义(P>0.05)；miR-21 inhibitor组细胞中miR-21表达明显低于和MDA-MB-231组(P<0.05)，miR-21可成功转染到MDA-MB-231细胞中(图1)。

注：A：MCF10A和MDA-MB-231细胞中miR-21表达，B：转染后3组细胞中miR-21表达比较。*与MCF10A细胞比较P<0.05；△与MDA-MB-231组比较P<0.05

2.2 敲低miR-21对细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡能力和E2F1表达的影响 与MDA-MB-231组相比，miR-21 inhibitor组细胞吸光度值、侵袭能力、迁移能力和细胞中E2F1蛋白表达均明显降低，细胞凋亡能力明显升高(P<0.05)；MDA-MB-231组细胞吸光度值、侵袭、迁移、凋亡能力和细胞中E2F1蛋白表达与miR-NC inhibitor组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注：A：细胞增殖能力比较；B：细胞侵袭能力比较；C：细胞迁移能力比较；D：细胞凋亡能力比较；E：细胞中E2F1蛋白表达比较。*与MDA-MB-231组比较P<0.05

2.3 E2F1和miR-21靶向关系预测和鉴定 预测软件显示E2F1的3′UTR端与miR-21有碱基互补结合点位，见图3-A。通过向MDA-MB-231细胞中转染野生型E2F1(E2F1-WT)时，miR-21组荧光素酶活性明显低于miR-NC组(P<0.05)；miR-21组和miR-NC组突变体荧光素酶活性相比差异无统计学意义(P>0.05)，见图3-B。

注：A：E2F1与miR-21的碱基互补结合点位；B：荧光素酶活性比较。*与miR-NC组比较P<0.05

2.4 干扰E2F1表达对细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡能力和E2F1表达的影响 和siRNA-NC组相比，siRNA-E2F1组细胞增殖、侵袭、迁移和细胞中E2F1蛋白表达均明显降低，细胞凋亡能力明显增加(P<0.05)，见图4。

注：A：细胞增殖能力比较；B：细胞侵袭能力比较；C：细胞迁移能力比较；D：细胞凋亡能力比较；E：细胞中E2F1蛋白表达比较。*与siRNA-NC组比较P<0.05

2.5 裸鼠肿瘤体积比较 与miR-NC inhibitor组裸鼠移植肿瘤第8天时相比，miR-21 inhibitor组裸鼠肿瘤体积明显降低，肿瘤抑制率为45.3%(P<0.05)，见图5。

注：A：裸鼠移植瘤生长曲线；B：裸鼠肿瘤体积比较；C：离体裸鼠移植瘤大小比较。*与miR-NC inhibitor组比较P<0.05

3 讨论

乳腺癌是发病率较高的女性常见恶性肿瘤，其中三阴性乳腺癌是乳腺癌中一种分子亚型。三阴性乳腺癌通常是指多种因子阴性表达的乳腺癌，包括雌激素受体孕激素受体和人表皮生长因子受体-2，其在所有乳腺癌分子亚型中发病率最高。有学者研究发现[11]，三阴性乳腺癌的基因表达特异性使其在临床治疗是具有局限性，化疗目前是治疗乳腺癌最有效的一种方法。目前常用的化疗药物包括紫杉类、蒽环类、抗代谢类等。迄今为止，临床对三阴性乳腺癌尚无标准的治疗指南。因此，探究三阴性乳腺癌有效的治疗方法是目前学者们研究的重中之重。miRNA是非编码单链小分子之一，其可以与其靶基因的mRNA 3′非编码区进行特异性的结合介导肿瘤发生发展，有学者研究发现[12]，抑制miRNA靶基因的表达可影响肿瘤细胞的多种生物学活性。miRNA在肿瘤中既有抑癌基因作用，又有致癌基因作用。抑癌miRNA对癌细胞有拮抗作用，致癌miRNA促进各种恶性肿瘤细胞的发生和发展，包括乳腺癌；同时，miRNA主要通过上皮-间充质转化参与调节三阴性乳腺癌的进展，可能与乳腺癌的诊断、治疗和预后有关。目前被第一个鉴定为哺乳动物miRNA的是miR-21，其在细胞中的表达和肿瘤发生密切相关。在人类多种肿瘤中均发现miR-21呈高表达，其可作用于多种靶基因，进而对肿瘤细胞的增殖、侵袭和凋亡进行调控。越来越多研究证明[13]，miR-21过表达常见于乳腺癌、食管癌、肺癌、结直肠癌等。张楹怡等[14]研究发现，向乳腺癌细胞MCF-7转染miR-21后增殖能力明显增强；同时细胞凋亡受到抑制，这提示miR-21可能与乳腺癌的进展有关。吴春锋等[15]对乳腺癌患者研究发现，miR-21在乳腺癌患者中呈高表达，且其可作用早期诊断乳腺癌的标志物。本研究结果显示，MDA-MB-231细胞中miR-21表达明显高于MCF10A细胞，与吴春锋等研究结果一致。通过转染低表达miR-21发现，低表达miR-21可抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡，促进MDA-MB-231细胞凋亡，且对细胞中E2F1蛋白表达也有明显抑制作用。且本研究通过裸鼠移植瘤结果显示，低表达miR-21同样可抑制肿瘤体积，进一步证实低表达miR-21可抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖。王贵年等[16]研究证实，敲低乳腺癌细胞中miR-21表达可抑制MCF-7细胞增殖，并促进MCF-7细胞凋亡。

本研究通过生物信息学在线软件分析得出，miR-21的可能靶基因为转录因子E2F1，抑制miR-21后，三阴性乳腺癌细胞中E2F1蛋白表达水平被抑制，证实miR-21和E2F1存在靶向关系。E2F转录因子1(E2F1)是E2F转录因子家族研究较多的成员之一，其可将E2识别位点结合到DNA上，进而对其下游的基因表达进行调控[17]。此外，E2F1能够参与卵巢癌、乳腺癌等多种妇科恶性肿瘤的细胞增殖、分化和凋亡，同时还参与了卵巢癌、子宫内膜癌的转移和化学耐药性[18]。王宏坤等[19]通过对乳腺癌细胞研究发现E2F1呈高表达，其与患者的总生存期、无复发生存和进展后生存密切相关。Zhao等[20]研究证实，高表达E2F1对乳腺癌细胞的生长有促进作用，抑制E2F1表达可阻断细胞周期，进而抑制细胞增殖。为了进一步证实低表达miR-21通过调控E2F1参与但阴性乳腺癌的生物学活性，本研究结果显示，敲低E2F1表达可抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭和细胞中E2F1表达，促进细胞凋亡，由此可见低表达E2F1对TNBC的生物学活性有同样调控作用。

综上所述，低表达miR-21可抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭，促进凋亡，且抑制裸鼠移植瘤体积，其作用机制可能与抑制E2F1表达有关。

利益相关声明：全部作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献说明：刘起鹏直接参与酝酿和设计实验，并对实验实施研究，采集数据，分析并计数数据；直接参与论文撰写，包括起草论文，及对论文的知识性内容作批评性审阅；直接给予工作支持，包括统计分析，获取研究经费等。张婷，郭婉莹均直接参与，包括酝酿和设计实验，并对实验实施研究，采集数据，分析并计数数据；直接参与论文撰写，包括起草论文，及对论文的知识性内容作批评性审阅；直接给予工作支持，包括统计分析，获取研究经费等。