先天性动脉导管未闭致病基因SOX18新突变的识别与功能研究

董斌斌 冒山林 陈果 刘兴元 杨奕清

动脉导管未闭（PDA）是最常见的先天性心脏畸形之一，在足月产新生儿中的发病率约为0.5‰，在早产儿中的发病率高达8‰[1]。先天性PDA 可因持续的主—肺动脉分流导致肺动脉高压、感染性心内膜炎、充血性心力衰竭甚至死亡[1]。既往研究表明，遗传缺陷和环境危险因素均可导致先天性PDA[1]。除了染色体异常可导致先天性PDA 外，单基因突变也可导致先天性PDA，包括PTPN11、TBX5、TFAP2B、MYH11、GJA5、PRRX1、KLF13、ILS1和MEF2C[1-5]。Shi 等[6]发现，转录因子基因SOX18突变可导致家族性PDA。然而，SOX18基因突变是否可导致散发性先天性PDA 仍有待研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

自2018 年4 月至2022 年7 月，来自同济大学附属同济医院134 例汉族散发性先天性PDA 患儿入选本研究病例组，其中79 例为男性，55 例为女性，年龄为2～14 岁，平均年龄为（6±4）岁。同期202 名汉族健康体检者入选本研究对照组，其中男性120 名，女性82 名，年龄为2～14 岁，平均年龄为（6±3）岁。全部入选者均经过家族史及病史调查、详细体检和超声心动图检查。依据超声心动图检查结果或心脏手术病史记录诊断PDA[3]。2 组入选者均排除了已知的可诱发PDA 的环境危险因素。本项研究遵守医学伦理学规范，并且获得同济大学附属同济医院医学伦理委员会的批准。经研究对象知情同意后，收集其临床信息和血液标本，常规提取基因组DNA。

1.2 方法

1.2.1SOX18基因扩增 通过聚合酶链反应（PCR）扩增SOX18基因编码区和剪接位点，引物序列见参考文献[6]。以入选对象的基因组DNA 为模板，应用合成的上述SOX18基因特异性扩增引物和DNA 聚合酶（德国Qiagen 公司）等试剂，在PCR 仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）上通过PCR 扩增SOX18基因。PCR 混合液的总体积设定为25 μL，其中包含有双蒸水12.25 μL、5×Q 液5 μL、10×PCR 缓冲液2.5 μL、上、下游引物（20 μmol/L）各 0.5 μL、DNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL 和模板基因组DNA（30 ng/μL）2μL。PCR 的条件见参考文献[7]：首先95℃预变性15 min，随后进入35 个热循环，每1 个循环包括94℃变性30 s、62℃ 退火30 s 和72℃ 延伸1 min，最后72℃ 延伸5 min。PCR 产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后割胶回收，使用凝胶DNA 纯化试剂盒（德国Qiagen 公司）进行纯化。

1.2.2SOX18基因的PCR 测序分析 以经过纯化的PCR 产物为模板，使用1 条SOX18基因扩增引物和DNA 测序试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司）在PCR 仪(美国Thermo Fisher Scientific 公司) 上进行Sanger 测序PCR。测序PCR 混合液的体积为20 μL，其中包含有PCR 产物即SOX18基因DNA 片段（20 ng/μL）2 μL、正向引物（2 μmol/L）1 μL、双蒸水9 μL 和预混合液8 μL。测序PCR 条件见参考文献[7]：总计30 个循环，每1 个循环包括95℃变性20 s、50℃退火15 s和60℃延伸l min。测序PCR 产物经纯化试剂盒（德国Qiagen 公司）纯化后在遗传分析仪(美国Thermo Fisher Scientific 公司)上进行凝胶电泳测序。通过比较分析所测的SOX18基因序列与核苷酸数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Nucleotide）中的SOX18基因序列（登陆号：NM_018419.3）可识别出SOX18基因突变。一旦发现SOX18基因突变，则测序分析202 名健康对照者的SOX18基因，同时检索万方数据库(https://s.wanfangdata.com.cn/advanced-search/paper）、PubMed 数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed）、人类基因突变数据库HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）和单核苷酸多态数据库SNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP），以明确所检测出的SOX18基因突变是否已有报道。

1.2.3SOX18基因突变的效应 通过在线计算机程序Mutation Taster2021（https://www.genecascade.org/MutationTaster2021/#transcript）模拟分析所发现的SOX18基因突变的致病性。

1.2.4SOX18基因突变体的功能研究 野生型SOX18的表达质粒SOX18-pcDNA3.1 及其靶基因NR2F2启动子驱动报告基因即萤火虫荧光素酶（luc）基因表达的NR2F2-luc 的重组构建见参考文献[6]。以野生型SOX18-pcDNA3.1 为模板，合成一对以突变点为中心、长各31 个碱基的互补引物（正向引物序列：5'-CGCAAGCGGCTG GCTTAGCAGAACCCGGACC-3'；反向引物序列：5'-GGTCCGGGTTCTGCTAAGCCAGCCGCTTG CG-3'），使用定点诱变试剂盒（美国Stratagene 公司）通过PCR 产生突变型SOX18-pcDNA3.1。经过DNA 酶Dpn I（美国NEB 公司）切除野生型SOX18-pcDNA3.1 模板、Sanger 测序证实获得突变型SOX18-pcDNA3.1。培养及表达质粒的共转染方法见参考文献[6]。转染质粒后48 h 收集、裂解HeLa 细胞。应用双荧光素酶（双报告基因）分析系统（美国Promega 公司）在荧光分析仪（美国Promega 公司）上定量分析荧光素酶活性（荧光强度）。以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的活性比值（比活性）表示靶基因NR2F2启动子的转录活性[6]。

1.3 统计学分析

2 组连续变量参数如入选者的年龄、靶基因NR2F2启动子的转录活性等的比较使用Student’st检验；2 组分类变量参数如入选者的性别、种族等的比较使用Pearson’sχ2检验。以双侧检验值P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 发现SOX18基因致病新突变

本研究中入选先天性散发性PDA 病例组（n＝134）和健康对照组（n＝202）均为中国汉族，2 组间性别构成差异无统计学意义（经Pearson’sχ2检验P＞0.05），年龄差异也无统计学意义（经Student’st检验P＞0.05），均无先天性心脏病阳性家族史。对SOX18基因进行测序分析，在1 例4 岁的散发性先天性PDA 患儿中发现了1 个杂合无义突变，即NM_018419.3:c.313C＞T;p.（Gln105*）突变。该SOX18基因突变在其他PDA 患儿和202 名对照者中均没有检测出，在万方数据库、PubMed数据库、HGMD 和SNP 数据库也均无报道，表明该SOX18基因突变是新发现的突变。该例散发性先天性PDA 患儿的SOX18基因c.313C＞T 杂合突变及纯合野生型对照DNA 序列见图1。

2.2 SOX18基因新突变c.313C＞T有致病性

SOX18基因新突变c.313C＞T 被Mutation Taster 2021 在线软件预测为致病性突变（deleterious），且该突变也不存在于ExAC、1000G和gnomAD 这些群体遗传学数据库（https://www.genecascade.org/MT2021/MutationTaster102.cgi），进一步表明该SOX18基因突变是1 种新突变。

2.3 Gln105*-突变型SOX18对靶基因NR2F2的转录激活功能丧失

在转染了多种基因表达质粒的HeLa 细胞中，0.6 µg 的野生型SOX18-pcDNA3.1 表达质粒和相同剂量（0.6 µg）的Gln105*-突变型SOX18-pcDNA3.1 表达质粒对靶基因NR2F2启动子的转录激活效应分别约为12 倍（12.41±1.30）和1 倍（1.11±0.52），纯合野生型与纯合突变型之间的差异有统计学意义（t＝14.04,P＜0.01）；而在同时转染0.3 µg 的野生型SOX18-pcDNA3.1 表达质粒和相同剂量（0.3 µg）的Gln105*-突变型SOX18-pcDNA3.1 表达质粒时，所诱导的转录激活效应约为6 倍（6.29±0.92），显著低于0.6 µg 的野生型SOX18-pcDNA3.1 表达质粒所诱导的转录激活效应（约12 倍），纯合野生型与杂合突变型之间的差异有统计学意义（t＝6.67,P＜0.01）。

3 讨论

本研究在1 例先天性散发性PDA 患儿发现了新的SOX18基因杂合无义突变即NM_018419.3:c.313C＞T;p.（Gln105*）突变。Mutation Taster 2021 软件模拟分析显示该SOX18基因突变有致病性。双报告基因定量分析表明Gln105*-突变型SOX18对靶基因NR2F2启动子的转录激活效应丧失。这些研究结果表明，SOX18基因新突变c.313C＞T 即p.（Gln105*）很可能是该例散发性先天性PDA 患者的分子病因。

SOX18基因定位于人类20 号染色体20q13.33，编码1 种由384 个氨基酸残基组成的转录因子，属于SOX 家族转录因子成员[6]。人类SOX18蛋白有2 个关键结构域，即转录激活结构域（TAD）和高移动基团结构域（HMG）。位于N 端的HMG 负责与靶基因启动子区域中一致的SOX结合DNA 序列(A/T)(A/T)CAA(A/T)G（核心序列是AACAA TG）特异性地结合；而位于C 端的TAD 负责转录激活靶基因，也可与转录合作伙伴结合一起协同转录激活靶基因的表达[8-9]。在胚胎发育期间，SOX18大量表达于心脏和血管，对胎儿心血管的正常发育具有关键调控作用，可能通过单独或与其转录合作伙伴NKX2.5和MEF2C协同调节对心血管发育具有重要作用的靶基因，如NR2F2和GATA4的表达[8-13]。此外，已经发现NR2F2、GATA4、NKX2.5和MEF2C基因功能缺失性突变均可导致先天性心脏病甚至PDA[5-6,14]。本研究所发现的错义突变预计会产生1 种截短的SOX18 蛋白，缺失了TAD 结构域和部分MHG 结构域，推测会导致功能异常。生化分析证实Gln105*-突变型SOX18 对靶基因NR2F2的转录激活功能丧失。这些研究结果表明SOX18基因单倍型不足是人类PDA 的分子病理机制之一。

在脊椎动物中，目前已经克隆了至少20 种SOX基因，这些基因被分成10 组（从A 到I），其中SOX18、SOX7和SOX17基因属于SOX基因族中的F 组（SoxF）。既往研究表明，SoxF 成员共同表达于心血管系统，在心血管发育期间调节细胞的特化与组织分化[15]。SOX18基因缺陷导致先天性心脏病可能与其所致的心血管异常发育有关。在人以及一些动物如小鼠、蟾蜍和斑马鱼中，SOX18在胚胎发育期大量表达于心脏和血管，在心血管正常发育方面发挥重要作用，主要调节内皮细胞和心脏起源的中胚层的特化和分化[8,11,15-16]。在蟾蜍中，Sox18或Sox7基因单独沉默均可导致心脏发育被部分抑制，而Sox18和Sox7基因同时沉默则可导致心脏发育被强烈抑制[16]。Sox18 mRNA 可以减轻Sox7基因沉默的心脏发育抑制效应，反之亦然，表明Sox18和Sox7基因功能上相互代偿[16]。在斑马鱼，Sox18或Sox7基因单独沉默仅导致轻微的血管畸形，而Sox18和Sox7双基因同时沉默则可导致严重的动静脉畸形而且完全外显[8]。在小鼠中，Sox17基因敲除可导致胎心环化异常、大静脉扩张和动脉畸形，而Sox18和Sox17双基因敲除则可导致更加严重的动、静脉和微血管畸形以及心内膜细胞分化异常；在过表达1 种显性抑制性突变型SOX18的小鼠中，发生了心血管发育异常所致的出血、水肿和胚胎死亡；单独敲除Sox18基因的小鼠无明显心血管发育畸形，可能主要由于Sox7和Sox17有代偿作用[15]。在人类中，SOX18、SOX7和SOX17这3 个基因的功能丧失性突变均被发现可导致先天性心脏病甚至PDA[6,10,17]。另外，TFAP2B基因突变可导致综合征型PDA，主要机制是通过干扰TFAP2B 对经典的Wnt/β-catenin 信号通路的抑制[18]。小鼠、蟾蜍和人的SoxF 组转录因子的C 端均有保守的β-catenin 结合域并且可与β-catenin 相互作用，抑制β-catenin/TCF 转录复合物的活性，进而抑制Wnt/β-catenin 信号[8]。本研究所发现的SOX18基因突变很可能通过相似的机制导致PDA。

值得注意的是，SOX18基因突变与人类疾病的关系已有报道。Shi 等[6]对1 个PDA 家系（部分PDA 患者合并有肺动脉狭窄，全部患者均合并毛细血管扩张）进行测序分析，发现了SOX18基因新突变NM_018419.3: c.349A＞T;p.（Lys117*），功能研究表明Lys117*-突变型SOX18 对靶基因NR2F2和GATA4的转录激活作用丧失。此外，SOX18基因突变还可导致主动脉扩张、肺动脉高压及毛细血管扩张-淋巴水肿-毛发稀少综合征等[19]。本研究发现SOX18基因新的突变导致PDA，扩大了疾病相关SOX18基因的突变谱。

总之，本研究识别出1 种新的SOX18基因功能缺失性突变，该突变可导致先天性PDA，这不仅揭示了PDA 新的分子病理机制，对PDA 的精准医学防治也有潜在的临床意义。