H7亚型禽流感病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

蒋文明，李金平，尹 馨，彭 程，刘 朔，李 阳，于晓慧，王静静，刘华雷

[中国动物卫生与流行病学中心 农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室(南方)，山东 青岛 266032]

2013年3月，我国发生人间H7N9感染病例，同时家禽中也检测到H7N9病毒，虽然动物试验证明从家禽中分离到的H7N9病毒对家禽是无致病力的，但还是给家禽业造成了巨大的经济损失[1,2]。随着H7N9病毒的演变，2017年以来，H7N9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)由弱毒株变异为强毒株，并导致多地暴发了H7N9亚型高致病性禽流感疫情[1,2]。免疫疫苗后疫情虽然得到有效控制，但家禽疫情仍时有发生，对H7N9及早做出诊断是切实做好疫病防控和保障养禽业健康发展的重要基础。因此，建立H7N9亚型AIV的快速检测方法是十分必要的。

目前AIV的分子诊断主要依靠反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)和荧光定量RT-PCR方法[3]。RT-PCR检测时容易造成实验室污染且只能定性检测，敏感性也相对较低；荧光定量RT-PCR方法在定量分析时需要使用标准品建立标准曲线。更准确和更灵敏的检测技术是分子检测的发展方向，与第1代普通PCR和第2代荧光定量PCR相比，数字PCR作为第3代PCR技术，在检测复杂来源样品中极低含量核酸分子和直接绝对定量方面具有无可比拟的检测优势[4]。数字PCR主要原理是通过DNA有限稀释法和泊松分布的统计原则来准确计算DNA的浓度，大大降低了体系中反应抑制因子的影响[5]。目前数字PCR已广泛应用到病原微生物检测和标准物质研究等研究领域[6-14]。根据数字PCR反应单元形成的原理，目前其主要分为3种：微滴式数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)、芯片式数字PCR和微流控芯片式数字PCR[15]。本研究通过对ddPCR检测H7亚型AIV的引物和探针浓度、退火温度、升降温速度、反转录时间等反应条件的优化，以及特异性、敏感性和重复性试验，建立了基于ddPCR技术的H7亚型AIV的检测方法，为H7亚型AIV的早期、快速、定量检测提供了新的技术手段，为H7亚型AIV的防控提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 病毒 经β-丙内酯灭活的H7N9、H5N6、H9N2亚型AIV、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒，均由中国动物卫生与流行病学中心保存。

1.2 主要仪器与试剂 数字PCR仪一体机(DQ24 Pro)，购自苏州思纳福医疗科技有限公司；荧光定量PCR仪(QuantStudio 5)，购自美国赛默飞公司。RNA提取试剂盒，购自济凡生物科技(苏州)有限公司；一步法RT-PCR试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；pMD18-T载体，购自宝日医生物技术(北京)有限公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；数字PCR试剂和耗材，均购自苏州思纳福医疗科技有限公司。

1.3 引物和探针 根据GenBank和GISAID公开的H7亚型AIV的血凝素(Hemagglutinin，HA)基因序列，设计引物和探针。上游引物H7-F：CTA ATT GAT GGT TGG TAT GGT TTC，下游引物H7-R：AAT TGC CGA TTG AGT GCT TTT，探针H7-P：FAM-CAG AAT GCA CAG GGA GAG GGA ACT GCT-BQH1。引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.4 重组质粒标准品的构建与鉴定 按照RNA提取试剂盒说明书提取H7N9病毒RNA，作为模板，采用一步法RT-PCR试剂盒，以上、下游引物(H7-F和H7-R)扩增HA基因片段，扩增产物预期大小为87 bp；使用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后连接至pMD18-T载体，构建重组质粒pMD18-H7，通过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切进行鉴定。使用分光光度计测定质粒标准品浓度后按照公式(1)计算标准品拷贝数。

Copies/μL=6.02×1023×dsDNA质量浓度(ng/μL)×10-9÷相对分子质量(g/mol)

(1)

1.5 ddPCR反应条件优化

1.5.1 引物和探针浓度的优化 设置ddPCR反应体系(20.0 μL)：One-step ddPCR supermix 5.0 μL，Reverse transcriptase 2.0 μL，300 mmol/L DTT 1.0 μL，模板(H7N9亚型AIV核酸)2.0 μL；引物和探针组成设置3个组合，分别为600和150 nmol/L、900和250 nmol/L、1 200和350 nmol/L；用水补齐至20.0 μL。PCR扩增程序：50 ℃ 20 min；95 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，40个循环；98 ℃ 10 min；12 ℃ 60 min；升降温速率设置为2.0 ℃/s。

1.5.2 退火温度的优化 根据1.5.1引物和探针浓度的优化结果配制反应体系。PCR扩增程序设置4个不同退火温度：50 ℃、53 ℃、55 ℃、58 ℃，其他程序同1.5.1。

1.5.3 升降温速度的优化 根据1.5.1引物和探针浓度的优化结果配制反应体系。PCR扩增程序采用1.5.2优化好的退火温度，设置3个升降温速度：1.0 ℃/s、2.0 ℃/s、3.0 ℃/s，其他程序同1.5.1。

1.5.4 反转录时间的优化 根据1.5.1引物和探针浓度的优化结果配制反应体系。PCR扩增程序设置2个反转录时间：15 min和20 min，其他反应参数为优化后的反应条件。

1.6 标准曲线的建立 将1.4中制备好的重组质粒标准品稀释至100、101、102、103和104copies/μL，利用优化后的反应条件进行ddPCR检测，每个浓度设3个重复，以不同拷贝数的标准品为横坐标，以ddPCR检测的实际拷贝数为纵坐标，建立ddPCR标准曲线。

6月14日，全球高新技术工程和工业领域的重要领军者法国登莱秀集团（Groupe Delachaux）宣布已经于5月29日在武汉成立了新的工厂，以满足亚洲市场不断增长的需求和实现公司在亚太地区扩张的目标。截止2017年年末，亚太地区的销售额已经占其总销售额的29%。登莱秀集团武汉工厂占地面积14 000 m2，雇佣人数超过200人。该工厂生产登莱秀集团在铁路基础设施以及能源和数据管理系统设施领域的全系列产品，是登莱秀集团全球唯一在同一厂房内生产这两种类型产品的工厂。该工厂是登莱秀集团在亚洲的旗舰，充分体现了集团的技术实力，以及在管理、环境和安全方面的最佳实践。

1.7 特异性试验 提取H7、H5、H9亚型AIV、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒RNA，反转录cDNA作为模板，用建立的ddPCR方法分别进行检测，分析该方法的特异性。

1.8 重复性试验 选取4个不同浓度的重组质粒标准品，分别进行批内重复性试验和批间重复性试验，每份样本重复检测8次，计算标准偏差和变异系数。

1.9 敏感性试验 将1.4中制备好的重组质粒标准品进行10倍倍比稀释(10-8～10-13)，利用优化后的ddPCR方法检测敏感性。同时进行荧光定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)试验，比较2种检测方法的灵敏性。

1.10 临床样本的检测 利用建立的ddPCR方法对60份临床疑似H7亚型AIV感染样品进行检测。同时采用鸡胚分离方法进行病毒分离，比较2种方法的符合率。

2 结果

2.1 重组质粒标准品的构建与鉴定 以H7N9亚型AIV RNA为模板，扩增得到HA基因片段，连接至pMD18-T载体，重组质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，电泳结果显示，插入片段的大小与预期一致(图1)，测序结果正确，重组质粒命名为pMD18-H7。使用分光光度计测定质粒标准品浓度，计算重组质粒标准品拷贝数为8×1011copies/μL。

图1 重组质粒标准品pMD18-H7双酶切鉴定

2.2 ddPCR反应条件优化 对引物和探针浓度、退火温度和升降温速率等条件进行优化，结果显示，引物和探针反应浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L、退火温度为55 ℃、升温速率为2.0 ℃/s、反转录时间为20 min时，H7亚型AIV核酸样品拷贝值最高，数值最稳定，为ddPCR最优反应条件(图2)。

图2 ddPCR反应条件优化

2.3 标准曲线的建立 将重组质粒标准品稀释至100、101、102、103和104copies/μL，每个浓度进行3个重复检测，建立标准曲线(图3)，计算出相关系数R2=0.999 2>0.99，线性关系良好，表明该检测方法可靠。

图3 ddPCR方法标准曲线

2.4 特异性试验 用建立的ddPCR方法分别对H7、H5、H9亚型AIV、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒进行检测，结果显示，H7亚型AIV检测结果为862 copies/μL，其他病原均为0 copy/μL，表明该检测方法特异性较好。

2.5 重复性试验 重复性试验结果显示，组内重复性试验和组间重复性试验的变异系数(Coefficient of variation，CV)均小于3%(表1)，表明该方法具有良好的重复性。

表1 ddPCR重复性试验

2.6 敏感性试验 将制备好的重组质粒标准品进行10倍倍比稀释(10-8～10-13)，利用优化后的ddPCR方法检测，最低检测下限为0.8 copies/μL，ddPCR方法敏感性比荧光定量PCR(qPCR)方法高10倍(表2)，表明建立的ddPCR方法敏感性较好。

表2 ddPCR与荧光定量PCR方法敏感性比较

2.7 临床样品的检测 对临床上疑似感染H7亚型AIV的60份样品进行ddPCR检测，12份检测结果为阳性，48份为阴性，与鸡胚分离方法结果一致，符合率为100%,表明建立的ddPCR方法可以对临床样品进行有效检测，并可进行定量分析。

3 讨论

2007年以来，H7N9亚型高致病性禽流感疫情时有发生，且病毒不断变异，给养禽业造成了巨大经济损失[16]。疫苗使用后，病毒的隐蔽性更强，导致病毒感染早期不易被发现，更准确和更灵敏的检测手段是未来发展方向。数字PCR作为第3代PCR技术，具有更高灵敏度和直接绝对定量的优势。数字PCR作为新一代分子诊断手段，越来越多地被应用于病原检测等领域[11,12]。目前，利用ddPCR技术对H7亚型AIV的研究和应用相对较少。

引物和探针浓度过低会导致拷贝数降低，浓度过高则会抑制PCR反应。退火温度过低会影响引物和探针与模板的结合效率，温度过高会影响微滴的扩增效率。升降温速度过快会影响微滴的稳定性，也会影响数字PCR扩增效率，升降温速度过快或过慢均会影响试验效果，导致阳性微滴散乱。本研究针对H7亚型AIVHA基因序列设计特异性引物和探针，并进行了最佳引物探针浓度、最佳退火温度、最佳升降温速度、反转录时间等反应条件的摸索，建立了H7亚型AIV ddPCR检测方法，并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示，最佳引物浓度和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L，最佳的退火温度为55 ℃，最佳升降温速度为2.0 ℃/s，最佳反转录时间为20 min。

特异性和重复性试验结果显示，建立的ddPCR方法具有良好的特异性，与其他常见禽病病毒不发生交叉反应，仅能检测出H7亚型AIV，且重复性较好。该方法的检测结果与重组质粒标准品拷贝数的相关系数为R2=0.999 2，表明该方法具有良好的线性关系和可信度。敏感性试验结果显示，建立的ddPCR方法最低检测限度为0.8 copies/μL，敏感性比qPCR高10倍，具有较高的灵敏度，表明该方法在早期感染或潜伏感染检测以及免疫效果评估中具有巨大的应用价值。

对60份临床样品的检测结果显示，建立的ddPCR方法可以对临床样品中的病毒含量进行绝对定量，并与鸡胚分离方法结果一致。因此，本研究建立的ddPCR方法特异性强、灵敏度高，能够快速检测到样本中含量极低的H7亚型AIV，适用于H7亚型AIV的痕量检测、流行病学调查、诊断方法评估、标准物质研制、免疫效果评估，为H7亚型AIV的科学防控和研究提供了有力的技术储备。