基于Notch信号通路探讨外用中药在慢性难愈性创面中的应用*

陈思琪,黄子慧

南京中医药大学附属南京市中西医结合医院,江苏 南京 210021

慢性难愈性创面是指经1个月以上临床规范治疗仍未愈合也无愈合倾向的创面[1]。在各种病理因素的影响下,创面自我修复机制紊乱,无法按照正常愈合阶段达到解剖和功能上的完整性,就形成了慢性难愈性创面[2],其类别主要包括静脉性溃疡、缺血性溃疡、压力性溃疡、代谢性溃疡及感染性溃疡等[3]。该病治疗难度大、时间长、费用高,且并发症多、病死率高,严重损害患者的身心健康和生活质量[4]。随着社会人口老龄化,该病发病人数日益增加,给社会带来巨大经济负担,已成为外科临床研究的难点和热点。

慢性难愈性创面的形成机制十分复杂,一方面是当机体受损后,免疫系统激活,大量细胞因子、趋化因子、蛋白水解酶和活性氧被免疫细胞释放,免疫细胞的过度增长和炎症反应时间的延长使伤口修复过程失调[5-6];另一方面则是血管新生减少,创面血氧供应不足导致胶原蛋白合成不足,成纤维细胞、表皮细胞的增殖和迁移受限,也导致创面愈合延迟[7]。

Notch信号通路是一个在进化上非常保守的跨膜受体蛋白家族,能够调控多种细胞的生长、发育、分化和凋亡,在组织重塑过程中发挥重要作用[8]。该通路由4种受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)和5种配体(DLL1、DLL3、DLL4,JAG1、JAG2)组成[9]。大多数情况下,相邻细胞膜上的Notch受体与配体结合后,γ-分泌酶复合物水解被激活的受体,水解的Notch细胞内结构域(notch intracellular domain,NICD)通过其核定位信号易位至细胞核,结合并激活DNA结合重组信号结合蛋白Jκ(RBP-Jκ)影响Notch靶基因转录,从而促进Hes和Hey在内的一系列下游靶基因的表达,发挥其生物学作用[10-11]。

研究表明,Notch信号通路在多种慢性难愈性创面修复中发挥重要作用,主要与其参与调控上皮巨噬细胞和血管内皮细胞再生等伤口愈合阶段、促进血管生成、参与细胞迁移及上皮化形成等作用相关[12-15]。

1 Notch信号通路参与慢性难愈性创面的发展与修复

1.1 Notch信号与巨噬细胞极化巨噬细胞是一群具有高度可塑性和异质性的免疫细胞,贯穿了整个创面修复过程。巨噬细胞的表型和功能在不同刺激因子作用下可发生改变,极化为M1型和M2型[16]。M1型是经典活化型巨噬细胞,可分泌大量炎性细胞因子和趋化因子,促进免疫应答,在创面修复早期——炎症阶段发挥重要作用[17]。M2型是交替活化型巨噬细胞,可分泌大量抑炎细胞因子发挥抗炎效应,并促进组织修复与再上皮化[18]。由于巨噬细胞极化是动态可逆的,因此促进巨噬细胞由M1向M2型转换是创面由炎症反应转为修复性反应的关键[19]。

巨噬细胞上的Notch信号能促进巨噬细胞向M1型极化,并激活巨噬细胞促进炎症反应的发生[20]。研究表明,DLL4/Notch1轴在促进巨噬细胞M1型极化方面起关键作用,同时能够阻断巨噬细胞M2型极化[21]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)通过激活巨噬细胞Notch1/核转录因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路诱导M1型巨噬细胞极化,特异性敲除巨噬细胞Notch1可以减少LPS诱导的M1型巨噬细胞极化,减少炎症因子分泌[22]。此外,还有研究发现Notch信号通路可通过激活下游信号分子Hes1调节巨噬细胞表面的 SIRP-α蛋白从而使巨噬细胞的表型向M1极化[23]。

Notch通路对巨噬细胞表型的调控作用与其他多条信号通路存在相互协调作用。研究发现,Notch1通过NF-κB转录途径促进M1型巨噬细胞极化[20]。NF-κB通路还是TLRs和Notch通路的交集通路。在诱导M1型巨噬细胞极化的过程中,Notch通路与TLR通路之间存在相互作用,是通过上调NF-κB促进IRF8蛋白合成实现的[24]。NF-κB蛋白还可通过直接与NICD结合独立于RBP-J而起作用,激活非经典Notch信号通路[25]。研究发现,红景天苷在抑制M1巨噬细胞活化的同时下调了Notch1、Hes1的蛋白表达,其作用机制可能是通过抑制NF-κB通路的活性实现的[26]。

1.2 Notch信号与炎症反应创面炎症反应可刺激产生细胞因子并募集中性粒细胞和巨噬细胞,吞噬并能够清除创面细菌和其他异物,促进创面愈合。然而,创面炎症过度表达则会导致创面组织的稳态失衡和愈合延迟[27]。创面炎症反应受到炎症因子、趋化因子、生长因子等多种细胞因子的调控。

研究表明,在创面愈合过程中,Notch信号缺失能够降低炎症细胞因子的表达,导致创面早期愈合延迟;而在创面愈合晚期,巨噬细胞中Notch信号的激活有可能会导致创面过度炎症反应,抑制Notch信号可以降低炎症因子的表达,促进创面修复[28]。

白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等是重要的炎症因子,对早期创面愈合有重要作用。TNF-α可通过诱发多种炎症因子的表达、调节免疫功能和促进角质细胞的迁移与增殖等方式促进创面的愈合[29]。IL-1能够增强白细胞与内皮细胞的黏附、促进成纤维细胞增殖[30]。IL-6能够激活机体的防御机制,参与炎症反应和免疫应答,以防机体进一步受损[31]。研究表明,高水平的炎症因子伴随着Notch信号的激活,抑制Notch信号通路则能够抑制炎症因子的过度表达[32-33]。

炎症早期释放的炎性介质能够促进金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的表达。MMPs是一组内在Zn2+外在Ca2+依赖性酶家族,高水平的MMPs一方面可引起细胞外基质广泛水解,基膜破坏,进一步加重炎性细胞浸润;另一方面可通过降解血管管壁细胞外基质结构骨架抑制血管重塑,最终导致溃疡不易愈合[34-35]。许多研究证明,MMPs的异常表达是糖尿病足溃疡、慢性下肢溃疡等多种慢性难愈性创面愈合受损的关键因素[36-37]。在糖尿病动物模型中,抑制Notch信号通路能够降低 MMP-9 的过表达,从而维持细胞外基质稳态,改善胶原的累积,加速创面的愈合[38]。在烧伤家兔模型中,阻断Notch通路后,MMP-2、MMP-9生成增多,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth tactor,VEGF)和VEGFR-2生成减少,血管生成被抑制,创面愈合受阻[39]。

1.3 Notch信号与新生血管生成新生血管是创面血氧供应和营养的保证,其形成过程主要包括内皮细胞芽生、尖端细胞迁移、茎细胞增殖等[40]。VEGF家族是血管新生和修复的关键因素,主要通过与其家族受体VEGFR相结合来调节血管内皮细胞的迁移、增殖和募集,并促进血管通透性增加[41]。VEGF通路及其下游Notch信号是新生血管形成的关键调控因子,尖端细胞和茎细胞的生成过程受其调节[42-43]。

DLL4作为Notch信号通路的配体之一,当血管生成时,主要表达在血管出芽最前端的内皮尖端细胞,它与VEGF一起相互作用共同调控茎细胞与尖端细胞的分化、迁移和增殖等过程[10,44]。VEGF作为DLL4上游的信号调节因子,能增加DLL4的表达,而DLL4是通过上调VEGFR1、下调VEGFR2来抑制血管内皮细胞的过度增殖[45]。即VEGF对DLL4/Notch信号通路具有正向调控作用,而DLL4/Notch信号通路能够对VEGF进行负反馈调节。在血管内皮细胞中,DLL4/Notch信号通路的主要作用是抑制新生血管过量芽生,避免血管生成不良,改善血管灌注,促进功能血管网的形成[46]。有研究报道,消肿止痛合剂可以通过抑制 Dll4/Notch 信号转导促进新生血管生成,增加大鼠皮瓣微血管数量、密度,进而提高皮瓣成活率[47]。

JAG1是正常血管新生的关键调节因子,广泛表达于内皮细胞的尖端细胞中。JAG1的表达上调,能促进血管出芽、分支,是加快内皮损伤修复的重要途径[48],而内皮细胞上JAG1的缺失可导致血管平滑肌和血管出现致命缺陷[49]。JAG1能够拮抗DLL4介导的Notch信号通路的抑制血管芽生作用[50],还可以直接传递JAG1/Notch信号给尖端细胞来调节VEGFR3的表达,以促进血管生成[51],截断Notch1/JAG1信号通路[46]。有学者建立小鼠遗传模型,观察JAG1在伤口愈合动力学和血管生成中的作用,发现血管内皮细胞JAG1的过度表达增加了血管密度、成熟度和功能性,从而加速了伤口愈合[52]。

1.4 Notch信号通路与细胞增殖、迁移与上皮化成纤维细胞在组织修复过程中起到重要作用,当组织受损时,成纤维细胞能够分化为肌成纤维细胞并产生丰富的细胞外基质和胶原纤维,提供结构支架,与新生毛细血管等共同形成肉芽组织填补伤口缺损,为表皮细胞的覆盖创造条件[53]。在慢性创面愈合过程中,成纤维细胞向肌成纤维细胞分化受阻,伤口无法通有序愈合[54],其作用机制可能与Notch通路的调控作用有关。有学者观察到DAPT阻断或抑制Notch信号后成纤维细胞增殖明显减少,分化能力也逐渐减弱[55-56]。激活成纤维细胞上的Notch信号通路能够促进α-平滑肌肌动蛋白(α-smoot muscle actin,α-SMA)分泌,而α-SMA是成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程中的特征性表达[57]。用JAG1处理的角化细胞上清液培养成纤维细胞可促进成纤维细胞增殖以及I型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白分泌[58]。

人角质形成细胞(human normol keratinocyte,HNK)占上皮细胞的80%,在分化过程中可合成角蛋白构成皮肤角质层。当创面受损时,HNK通过改变自身表型降解与邻近细胞间的连接,从损伤边缘迁移至损伤局部并增殖[59-60]。HNK的适当迁移和增殖是创面再上皮化的保障[61]。反之,HNK增殖受阻则会导致慢性难愈性创面的发生。研究表明,激活Notch信号通路能够提升人永生化角质形成细胞(human keratinocytes,HaCaT)的增殖和迁移能力[62]。有学者构建Notch信号通路激活的HaCaT与成纤维细胞共培养系统,发现用γ-分泌酶抑制剂阻断Notch通路后,角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) 的分泌会明显下降[55]。敲低HaCaT细胞中NCSTN基因可以降低γ-分泌酶活性,削弱其对Notch信号通路的抑制,促进HaCaT细胞增殖[63]。王义等[62]报道人脂肪干细胞通过Notch信号通路促进裸鼠创面上皮再生与愈合,其机制可能与促进HNK的增殖与迁移有关。在兔耳创伤模型研究中,通过激活与阻断JAG1/Notch信号通路比较发现,Notch信号通路通过改变HNK表型影响其增殖、分化及分泌特性[58]。

表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)是广泛存在于人体多种组织的一种多肽因子,与其受体EGFR结合后可激活调控细胞增殖的调节生长基因,具有刺激HNK增生、分化,加快创伤愈合的作用[64-65]。Notch1通路也是HNK增殖的关键因素。然而,Roy等[66]研究发现,EGF能够对Notch1的表达产生负面影响,并猜测这可能是因为HNK的最佳增殖状态需要一个适合的Notch1表达水平,而EGF通过调节Notch1的表达来维持这种平衡。研究发现,EGF与Notch1信号通路存在着交互作用,其受体EGFR能够负向调节Notch1,维持细胞的增殖,并抑制细胞的分化[67]。王建峰等[68]研究发现,黄芩苷抑制HNK的活性的机制可能与抑制Notch信号通路活性有关,这也从另一方面验证了Roy的猜想。

表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)通过免疫调节、表皮再生、血管再生和胶原沉积等作用参与创面修复的全过程[69]。机体损伤后,ESCs迁移到损伤部位参与受损组织的再生,刺激驻留祖细胞的增殖和分化,通过分泌生长因子和重塑基质促进损伤细胞的修复[70-71]。施彦等[72]研究发现,大鼠慢性溃疡模型中创面组织免疫组化染色BrdU/Hes1双染阳性细胞率上升,JAG1、Notch1表达上调,并据此推测JAG1与Notch1结合后激活Hes1通路,参与并促进ESCs的增殖,加速创面愈合。Yang等[73]研究表明,下调Notch信号通路的JAG1配体能够显著降低ESCs的体外迁移。此外,在糖尿病小鼠创面模型中,过度表达的JAG1能够促进皮肤善创面愈合,其机制可能与JAG1促进ESCs的迁移有关。还有报道称Notch信号高度激活能够促使ESCs分化为角质形成细胞[74]。

2 外用中药靶向Notch信号通路干预慢性难愈性创面

慢性难愈性创面在传统医学中尚未发现明确病名记载,根据其临床表现可归为“疮疡”范畴,病因病机多为脏腑亏虚、湿热互结、气血瘀滞,日久脏腑功能失司,营卫阻滞,肌肤失养,久而创面溃烂,缠绵难愈[75]。《医学源流论》云:“外科之法,最重外治。”外治之法可使药力直达病所,提高临床疗效。中药及其复方制剂外用治疗慢性难愈性疮面疗效显著,种类繁多,然而其中大部分作用机制尚不明确。

2.1 中药单体外用中药能够多靶点干预慢性难愈性创面的发展与转归,但中药复方成分复杂,作用机制尚不明确。目前,直接使用中药单体外用治疗慢性难愈性创面的研究相对较少,能够靶向Notch信号通路作用的主要有紫草素和表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)。紫草具有清热解毒、活血消肿的功效,现代药理学研究发现,从紫草中萃取的紫草素是茶醌类天然色素,以紫草醌及其衍生物为主要成分,具有抗炎、杀菌等作用,对皮肤溃疡愈合有重要作用[76]。研究发现,紫草素外用可降低糖尿病大鼠慢性溃疡创面炎症指标,提高创面肉芽组织中羟脯氨酸含量,促进胶原合成,上调VEGF,下调Notch1蛋白表达,促进新生血管形成。谢军等[77]认为,紫草素可能通过协调VEGF通路与DLL4/Notch1通路之间的负反馈机制来促进新生血管的形成及创面愈合。陈微等[78]通过体外研究发现,紫草素呈剂量依赖性地抑制HaCaT细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,Notch-1信号通路在其中起了重要作用。EGCG是从茶叶中分离出的儿茶素类单体,具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等作用[79]。EGCG能够通过抑制Notch1信号通路的活化调节早期炎症效应[80-81]。研究表明[82],EGCG可直接与小鼠巨噬细胞中Notch1特异性结合,降低糖尿病小鼠创面Notch1表达水平,进而下调炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,减轻巨噬细胞介导的炎症反应,促进创面愈合,其作用机制可能与促M1型巨噬细胞向M2型极化有关。

2.2 中药复方外用中药复方制剂以其安全有效的优势被广泛应用于慢性难愈性创面的治疗中,目前报道靶向Notch通路治疗慢性难愈性创面的主要药物有生肌橡皮膏、紫朱软膏及肛痈方。其中生肌橡皮膏应用较为广泛,由当归、生血余、橡皮粉、生地黄、生石膏、龟甲、炉甘石等组成,主要功效为生肌敛疮,能止痒收敛,吸收创面分泌物,起到防腐收敛,保护创面的作用[83]。朱朝军等[84]观察到生肌橡皮膏在促进糖尿病大鼠溃疡早中期愈合的过程中,随着疮面面积的缩小,组织内VEGF的表达先升高后降低,而Notch1在组织内的表达趋势与VEGF相反,这表明生肌橡皮膏在促进创面愈合的过程中Notch信号起到一定干预作用,其作用机制可能与促进血管新生相关。李博文等[85]应用生肌橡皮膏治疗糖尿病大鼠足溃疡,发现创面Notch1的表达被抑制,同时炎症因子IL-2、IL-6、TNF-α的表达下降,创面炎症反应减轻,愈合速度加快。罗泽琴等[86]将自制生肌膏运用于肛周脓肿术后,发现其可促进大鼠肛周脓肿术后创面愈合,其作用机制也与抑制创面Notch1表达,下调炎症因子水平相关。紫朱软膏主要由紫草、朱砂、阿胶、龙血竭、冰片、黄芪制成。方中紫草活血凉血,朱砂解毒祛腐,二者同为君药,共奏清热解毒祛腐之效;黄芪补气生肌,阿胶补血滋阴,血竭活血定痛、生肌敛疮,为治疗溃疡不敛的主要药物,共为臣药;冰片为佐药,能够通透肌肤、镇静止痛。诸药合用,共奏清热解毒、祛腐生肌、补气益血之功效[87]。韩强等[88]报道紫朱软膏可能是通过抑制Notch信号通路来降低糖尿病足溃疡大鼠创面炎症因子和炎症趋化因子水平,减轻创面炎症反应强度,并提高生长因子TGF-α、TGF-β表达,促进创面愈合。肛痈方主要由当归、黄柏、延胡索、乳香、珍珠粉和冰片组成。方中水牛角清热凉血、解毒定惊,牡丹皮清热凉血、活血化瘀,两药配伍活血化瘀,能够促进创面血液循环,增加血管通透性,有效缓解创面水肿及渗液;黄芪升阳举陷、托毒生肌;穿山甲与皂角刺二药相须为用,具有消肿散结、托毒透脓之效。研究发现[89],肛痈方能够通过下调创面炎症因子IL-2、IL-6、TNF-α水平,有效抑制大鼠肛周脓肿创面炎症反应,促进创面愈合,其机制可能与下调Notch1、TGF-β1的表达有关。

3 小结

Notch信号通路作为人体内重要的信号转导途径,参与多种生理活动,可以通过调节巨噬细胞极化、促进炎症反应、促进血管新生、加速创面再上皮化等多种途径参与慢性难愈性创面的修复。目前,关于Notch信号通路在慢性难愈性创面中的研究仍存在以下问题:(1)有关Notch信号通路在慢性难愈性创面中的研究不统一,通过激活或是抑制该信号通路从而达到治疗目的仍有争议,这可能与研究所使用的动物模型、创面类型与分期、具体作用机制有关;(2)通过该信号通路治疗慢性难愈性创面作用的靶点尚不清晰,仅以少数几个经典靶点蛋白做支撑,无法系统判断该通路在慢性创面愈合中的参与程度,与其他信号通路之间的交互作用同样缺乏系统研究;(3)大部分中药复方制剂调控Notch信号通路发挥作用的具体机制尚不明朗,多是以某一下游或上游关键靶点蛋白表达水平做支撑佐证相应的观点,少有对多个靶点蛋白进行系统的研究。今后,还需进一步明确各靶点间的相互作用,对中药靶向Notch通路治疗慢性难愈性创面进行更为系统的研究,有助于该病特异性治疗药物的研发。