间歇浸没式生物反应器在植物组织培养中的应用研究进展

许 凤 ，张丽芳 ，苏 艳 ，蒋亚莲 ，王丽花 ，瞿素萍 ，张艺萍 ，2

（1.云南省农业科学院 花卉研究所/国家观赏园艺工程技术研究中心/云南省花卉育种重点实验室/昆明市花卉遗传改良重点实验室，云南 昆明650205；2.云南云科花卉有限公司，云南 昆明 650205）

植物组织培养技术从20 世纪60年代开始迅速发展并逐步成熟，大量应用于苗木快繁生产。传统的植物组织培养采用固体培养基培养体系，主要包括外植体诱导、继代、生根培养基的制备，外植体的采集、消毒、接种，外植体成功诱导出不定芽或愈伤组织以后的分化继代培养，继代增殖形成的无根芽苗生根培养，炼苗和移栽等技术环节，每个步骤都需要大量的劳动力，成本高、效率低。相对于固体培养，液体培养是另一种组织培养改进的方式，虽然该培养方式便于成本控制，但长时间的液体培养会引起组培苗玻璃化、畸形等问题。

植物间歇浸没式生物反应器的基本原理是在无菌条件下，将无性繁殖材料在培养液中进行周期性的浸泡培养，其改进了液体培养的方式。在这种培养方式下，植物组织与液体培养基紧密接触，刺激和促进了植物组织对营养元素和激素的吸收；间歇及连续振动给液体培养基提供了足够氧气，提高了组培苗的繁殖系数。植物间歇浸没式生物反应器主要应用于快繁后期繁殖苗和生根苗的培育，其人工耗费是固体培养系统的1/2，成本可降低1/5，促进了自动化、机械化和商业化的植物快繁技术发展。

迄今，国外应用间歇浸没式生物反应器进行组织培养成功的植物有香枫[1]、苹果[2]、菠萝[3]、挪威云杉[4]、白纹栎[5]、甘蔗[6]、甜叶菊[7]、香石竹[8]、白杨[9]等，而国内的研究开始较晚，主要集中于次生代谢物的生产。与传统植物组织培养相比，间歇浸没式生物反应器优势明显，其自动化程度高、生产成本低、组培苗质量好、繁殖系数高、移栽成活率高及适应性强。为更好地将该技术装备应用到植物组织培养中，笔者概述了间歇浸没式生物反应器发展的阶段、参数设置及优缺点等方面的进展。

1 间歇浸没式培养系统的发展

间歇浸没式培养系统的发展大概经历了5 个阶段，其中第3、4、5 阶段发展的培养系统目前都还有应用，如气泵驱动RITA（Recipient for Automated Temporary Immersion）间歇浸没式培养系统也还在应用中，只是在不断地改进中。

1.1 第1 阶段

1985年，TISSERAT 等[10]设计了APCS（Automated Plant Culture System）自动化植物培养系统。整个系统由4 个部分构成：植物培养箱、玻璃营养液蓄池、叶轮泵及硅胶运输管道。该系统由微型计算机控制，在叶轮驱动下实现了培养液的定期补充和排干，获得了与传统组织培养相同的效果，但避免了繁琐继代工作，降低了劳动成本。

1.2 第2 阶段

1987年，AITKEN-CRISTIE 等[11]不断改进APCS 培养系统，设计出一套半自动培养系统，将叶轮泵改为蠕动泵，将玻璃的营养液蓄池改为聚碳酸酯的营养液蓄池。每次液体更新40～60 mL，每周6～7 h；在供应营养液时通气保证了培养物的氧气需求，比无通气培养效果更好。基于此，SIMONTON 等[12]于1991年设计出一套用于间歇供应液体的计算机控制泵，有4 台培养容器，用带孔聚丙烯代替琼脂培养基，使营养循环实现预定的设计。第1、2 发展阶段的培养系统培养周期较长，通气和补液控制不好会导致污染。

1.3 第3 阶段

1993年，ALVARD 等[13]设计了气泵驱动RITA（Recipient for Automated Temporary Immersion）间歇浸没式培养系统。该系统由2 个容器构成，下面是营养液存储容器，上面是培育容器，中间连接有管道。当气体进入营养液存储容器时，都要通过0.22 μm 孔径的滤膜以防止污染。应用这一系统对香蕉进行培养，与传统的固体培养基、液体培养基培养比较，该培养系统的繁殖系数可提高1 倍，干质量可提高1～4 倍[13]。该系统容器体积小，结构复杂，价格昂贵，限制了其在发展中国家的推广。

1.4 第4 阶段

1999年，ESCLONA等[14]设计，后来由TEISSON改进命名的间歇浸没式生物反应器系统（Temporary Immersion Bioreactors System，TIBS）出现，其主要包括空气压缩机、营养液存储瓶、组培苗培养瓶、硅管、时控开关、滤膜孔径0.22 μm 的针头过滤器、电磁阀、培养架等部分。该系统的基本原理是以空气压缩机所形成的空气压力作动力，经过滤器除菌将液体培养基由储存瓶压入组培苗培养瓶，从而对植物组培苗进行间歇浸没式培养。该系统培养菠萝苗，以2 min/3 h 的浸没频率提供营养，在含多效唑激素的培养基中生长42 d 后，繁殖系数明显提高，干、湿质量均显著增加[14]。该系统目前比较常用，但培养周期长且易污染，仍需进一步改进。

1.5 第5 阶段

2010年至今，研究者不断优化之前的设计。SOLÓRZANO 等[15]设计了一套低成本的气动临时浸没式生物反应器系统，该系统有24 个2 L 的水箱。该自动化系统通过设计的定时器电路执行，其设计参数设置为：一是繁殖培养周期，该参数取决于所培养植物的繁殖周期，由操作员决定何时关闭系统；二是浸没频率，分别设定了1、2、3、4、5、6、7、8 h 的间隔浸泡时间（对应间隔通气时间）和30、40、50、60、70、80 s 浸泡时间（对应压缩空气输送时间）；凤梨在这种浸没生物反应器系统中培养30 d后繁殖系数为6.5[15]。

FLOREZ 等[16]设计了一种新的TIB（Temporary Immersion Bioreactors），一种静压驱动的TIB（Hydrostatic-driven TIB），该设计的原理是：培养基流入反应器是通过相对于培养容器升高培养基贮槽来实现的。其特点是定期升降培养基贮槽的高度可以保持植物组织临时浸入，而不需要大量的气体来压入培养基。利用含氧量较高（40%）的气体混合物可使植物发状根培养物的生长速度加倍，并且补充二氧化碳可提高无籽西瓜分生组织培养物的光合能力。该系统的总体设计力求实现功能多样性、可扩展性和最低成本等。面对日益增长的粮食需求、资源减少和环境退化等问题，生物反应器技术在提高植物生产力方面发挥着越来越大的作用。

2 间歇浸没式生物反应器相关参数设置的研究进展

与传统的组织培养类似，由于培养基的成分、激素组成和水平、蔗糖浓度、pH 值等各种培养条件不同，利用间歇浸没式生物反应器进行植物组织培养的效果存在差异。此外，间歇频率、浸没时间、培养器容积、接种密度等参数对应用生物反应器进行植物组织培养的效果也有很大影响。

2.1 浸没频率和培养时间

不同植物种类对浸没频率和浸没时间的要求是不一样的。如果浸没频率大，组培苗就容易发生玻璃化；但如果浸没频率小，就会影响植株的营养吸收，对其生长有影响。同样，间歇浸没时间太短也会影响植株的正常生长；浸没时间太长，组培苗会因氧气缺乏而产生玻璃化、畸型等现象。因此，在应用间歇浸没式生物反应器继代1 个物种之前，必须先测试其适宜的间歇频率。

ZHU 等[17]在培养苹果生根苗时发现，每天浸没16 次比浸没8 次的效果更好。ALVARD 等[13]在利用间歇浸没式生物反应器对香蕉组培苗培养后发现，浸没频率为每周2 次比每周1 次的效果更好。浸没时间是间歇式浸没培养的关键技术环节之一，对培养效率起决定性作用。ALBARRÁN 等[18]在研究咖啡间歇浸没培养参数发现，15 min/4 h 的浸没频率会产生90%的玻璃化苗；而1 min/4 h 的浸没频率可以形成大量鱼雷胚，无玻璃化苗，75%的苗可以再生为完整植株。廉美兰等[19]在利用间歇浸没系统研究辰星草快繁时发现，其生长分化最理想的间歇频率是每隔2 h 供给1 h 的培养基。JOVA 等[20]用间歇浸没式生物反应器在多个山药品种组培快繁的生长过程中发现，山药在间歇频率为10 min/6 h 时，其繁殖率和生长状况是最理想的。DAMIANO 等[21]在间歇浸没式生物反应器中培养野生梨和梨时发现，野生梨最适宜的浸没时间为30 min/d，梨最适宜的浸没时间为60 min/d。但也有一些植物种类对浸没频率的变化并不敏感。KONGBANGKERD 等[22]对海葱（Charybdis numidica）进行研究发现，在5 min/12 h 和5 min/24 h 这2 种频率下，其芽的再生率并无明显变化。除浸没频率、浸没时间以外，培养时间对培养效果也有影响。研究发现，车前草继代培育6 代之后，繁殖系数下降十分明显[12]；菠萝组培苗在继代培育7 周内的繁殖系数是最高的，但组培苗的活力明显下降[23]。

浸泡次数对幼苗生长发育也有影响。ZHANG等[5]分析了浸泡次数对白纹栎幼苗发育的影响，结果发现，浸泡频率为3 min/2 h 时，可以显著促进假球茎的发育。GAO 等[24]采用间歇浸没式生物反应器（TIBS）对慈姑的繁殖和生长进行研究，结果表明，较高的浸没频率（每6 h 浸没1 次）和较短的浸泡时间（3、10 min），其繁殖系数最高为23，显著高于传统的半固体培养（3.6）和液体培养（4.5）；而较低的浸泡频率和较长的浸泡时间（30 min/12 h 和60 min/24 h）其茎尖的玻璃化率和污染率分别为16.6% 和19.0%、42.0% 和37.0%；与传统的半固体和液体培养相比，TIBS（10 min/6 h）的污染率（8.3%）明显降低；在含BA 4 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培养基中，每6 h 浸泡10 min，具有较高的芽繁殖系数，达21.6，生根率为100%，成活率为94%。FRÓMETA 等[25]对在非洲菊上应用间歇浸没式生物反应器的浸泡频率（1 次/6、8、12 h）、额外通风和培养时间（14、21、28、35 d）等因素进行了调查，结果发现，每8 h 浸没加通风可增加不定芽数量且形态好，每个外植体平均繁殖系数为9；而每6 h 浸没处理的嫩枝鲜质量和干质量较高，但同时水分含量较高；浸没频率为每8 h 浸没1 次和每12 h 浸没1 次时，枝条的水分含量无显著差异；额外通风（12 min/d）使枝条的水分含量降低到5.24%，而无通风处理的为31.37%；每8 h 通风一次的枝条鲜、干质量降低，相对含水量下降89.8%；每个外植体分化的芽数量在14 d 时为3.5 个，21 d 时为5.5 个，28 d时为6.7 个，35 d 时为6.1 个。ZHANG 等[26]以半夏为材料，在间歇浸没式生物反应器中对半夏幼苗进行了快繁研究，调查9 种不同的浸液循环对幼苗增殖、生长和多糖含量的影响，确定最佳浸液循环为wasIC-6（每12 h 浸5 min）。GAO 等[27]以荸荠球茎和匍匐根茎为材料，采用间歇浸没式生物反应器（TIBS）对其茎尖进行繁殖，发现培养优化条件下（15 min/8 h）的繁殖系数最高，并能降低玻璃化率。

2.2 培养器体积空间

培养容器空间的大小对间歇浸没式生物反应器系统的繁殖效率影响是很大的。在现实的生产和科学试验中，为了减少继代次数、提高效率，间歇浸没式生物反应器采用的培养器体积一般为1～20 L，其体积大小远大于固体培养基组织培养过程中所用的果酱培养瓶，可以几个月或10 个月以上才转接1 次。一般而言，在组织培养过程中，培养器的体积越大，培养器顶部空间就越大，这样就能提供足够的空间给组培苗生长，避免植物组培苗在培养器中过度拥挤，有利于植物组培苗的生长。采用更大的空间，有利于通气处理，从而改善瓶内气体组成，提高育苗质量和繁殖系数。ESCALONA等[14]在应用间歇浸没式生物反应器培养菠萝苗时发现，培养液的体积大小对繁殖速度、湿质量及干质量也有很大的影响，在生长过程中培养物长大后就会发生拥挤，培养物的质量下降。因此，在间歇浸没式生物反应器培养系统中应适当地扩大培养的面积、加大通气力度及减少对培养植株的空间限制，这样才能提高繁殖系数和组培苗质量。

2.3 激素

灵活地应用激素可以大大提高组培苗繁殖的效率。限制大规模生产的关键因素在于单位产品成本高，合理使用激素提高繁殖系数和驯化成活率可大大降低成本。在菠萝的大规模组织培养过程中，采用多效唑可提高腋芽的繁殖系数[14]。在金丝猴属的植物组织培养过程中，可用噻苯隆（TDZ）来提高繁殖系数，再用其他激素来提高生根率和炼苗成活率[28]。在碟兰球茎组织培养的不同阶段，采用不同激素的培养基可获得较高的繁殖系数，降低间歇浸没式生物反应器的培养成本[29]。GAO 等[27]在含有4 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA 的MS 培养基中应用间歇浸没式生物反应器培养荸荠苗时发现，荸荠芽繁殖系数最高。

2.4 接种密度

接种密度是影响间歇浸没式生物反应器培养效果的关键因素之一，不同的植物种类对接种密度的要求是不一样的。接种密度太低不仅影响到组培苗的繁殖系数，还会影响到组培苗生长，且浪费培养基，增加生产成本；如果接种密度太大，则会由于苗量过多而导致植株过度拥挤，从而影响组培苗的正常生长，引起组培苗变异，对生产者造成巨大损失。ESCALONA 等[14]使用间歇浸没式生物反应器对菠萝进行组织培养时发现，当接种密度为5 株/L 时，菠萝组培苗的繁殖和发育状况是最好的。ZHANG 等[26]以半夏为材料，发现初始接种密度对繁殖系数和幼苗质量也有重要的影响。结果表明，繁殖系数、单株鲜质量及叶面积随接种密度的增加而降低。在60 个/L 外植体的接种密度下，每个生物反应器的鲜质量最高，为762.18 g。较高的接种密度（每升80、100 个外植体）导致植株发育不良。ZHANG 等[5]分析了接种量对白纹栎幼苗发育的影响，发现在TIBS 槽中接种300 株外植体，幼苗在茎粗、株高及叶宽方面的发育最好，其假鳞茎的发育也得到了明显促进。

2.5 接种材料的质量

与采用固体培养基进行植物组织培养技术相比，在生物反应器体系中，接种材料质量好坏也会对植物组培苗的繁殖系数产生影响。杨柳等[30]在利用间歇浸没式生物反应器培养甘蔗时，以第4 代通过半固体培养基诱导的组培苗为接种材料，甘蔗组培苗的增殖及生根情况较好。ROELS 等使用间歇浸没式生物反应器系统快速繁殖香蕉时，发现当接种材料是第6、7 代香蕉继代组培苗时，香蕉繁殖系数较高，生长情况较好[19]。IKRAM-UL-HAQ等[31]使用间歇浸没式生物反应器系统进行香蕉组织培养得出的结论与ROELS 等的结论类似。

在应用间歇浸没式生物反应器进行植株快繁时，要充分考虑应用的接种材料，一定要选用继代次数少的繁殖苗作为接种材料；其次在培养基配方上也要进行充分的筛选，以选择最适宜的繁殖和生根阶段的培养基配方；再次应针对不同体积的培养容器筛选适宜的接种密度；最后对浸没频率和培养时间也应进行充分研究。

3 间歇浸没式生物反应器扩繁植物的优势

应用间歇浸没式生物反应器培养植株的优势是很明显的，主要体现在3 个方面。

3.1 繁殖的组培植株质量好且繁殖系数高

在间歇浸没式生物反应器中，培养物间歇浸没于液体培养基和间歇性处于通气环境。气液交替和干湿交替，避免和减少了液体培养产生畸形苗和玻璃化苗等不良生长状态，改善培养植株的叶绿素含量、净光合率及蒸腾速度等生理指标，组培植株生长得更好[32]。间歇浸没培养能提供足够的营养和氧气，减少培养环境中不利气体的积累。例如，ROELS 等[33]在研究芭蕉的浸没培养时发现，间歇浸没式生物反应器可以大大减少培养空间中二氧化碳（5.7%）和乙烯（0.06 μL/L）的浓度，从而保证芭蕉小植株能快速生长，且品质较好；而在半固体培养基上培养芭蕉，二氧化碳和乙烯浓度分别达到最大值12%和0.45 μL/L。在半固体培养基上最低氧浓度为15.1%，而间歇浸没式生物反应器中氧浓度更高，为19.3%。间歇浸没式生物反应器中芭蕉繁殖系数为6.4，而在半固体培养条件下为4.3，芽高（4.3 cm 与3.3 cm 相比）和叶数（2.6 与1.6 相比）也是如此。而且在半固体培养基上培养的畸形苗较多。利用间歇浸没式生物反应器继代培养芭蕉苗，可以明显减少芭蕉苗的继代接种次数，更新培养基相对容易，继代材料能长时间生长于一致的继代培养环境及培育状态，明显提高芭蕉繁殖苗的培养质量及繁殖系数，进一步提升了芭蕉产量[34-35]。

KIM 等[2]比较了传统的固体、液体、间歇浸没式生物反应器培养系统生产脱毒苹果幼苗的效果，发现苹果植株鲜质量以间歇浸没式体系最高，枝条最长，约为固体培养的2 倍；苹果根系最长，根数也高于固体培养；植株的总茎面积最大，为1.46 mm2；同时间歇浸没式生物反应器培养能够在短时间内产生大量的脱毒植株，且植物茎中次生木质部发育良好。MAMUN 等[4]研究发现，挪威云杉（Picea abiesL.）在生物反应器中的产量比在固体培养基中高3～5 倍。MARZIEH 等[8]比较了间歇浸没式生物反应器（TIB）和固体培养康乃馨的效果，研究发现，应用3 mg/L 6-苄氨基嘌呤（BAP），在TIB 中的新芽数为14.3 个，但在相同处理下固体培养基上的新芽数为5.7 个；在TIB 中使用3 mg/L BAP，康乃馨的初始鲜质量在15 d 后从10 g 增加到450 g；在TIB 中的芽产量是固体培养基的10 倍以上；通过应用1 mg/L 吲哚丁酸（IBA），在TIB 中成功诱导康乃馨苗生根，与固体培养中的生根苗相比，TIB 中的根数最多（4.6 条）和根长度最高（6.87 cm）。EDWARD 等[9]利用间歇浸没式生物反应器进行树木类的快繁时发现，与固体培养基相比，在间歇浸没式生物反应器中培养外植体可显著提高桉树和白杨的繁殖率和鲜质量，但对毛桦木则无显著影响。

3.2 高效生产代谢物

甜叶菊因含有低热量的糖苷甜味剂而有益于糖尿病的治疗，其自然繁殖和营养繁殖效率低下。通过甜叶菊的离体繁殖技术生产天然甜味剂有望解决此问题，但其增殖率和再生率较低。KAREL等[7]比较了甜叶菊在半固体培养基、液体培养基及生物反应器中的生物量和甜菊糖苷的产量，发现在培养21 d 时，生物反应器中的再生苗形态质量最好，且其鲜质量和干质量比在液体或半固体培养基中高7 倍以上。生物反应器中产生的甜菊糖苷的总含量也较高。PRAMITA 等[36]研究生长调节剂和浸没频率对平卧菊三七在间歇浸没式生物反应器中生物量和黄酮类化合物产量的影响，发现在浸没频率为15 min/12 h 的条件下，结合MS+IAA 2 mg/L+BA 8 mg/L 的培养基培养，可获得最高的黄酮类化合物产量。

3.3 移栽驯化的再生植株品质好

用间歇浸没式生物反应器培养的植株比传统固体培养和液体培养的植株更容易驯化移植成活。ACANDA 等[37]将肖竹芋生根苗在有遮阴设施的温室中移栽驯化生长一段时间后发现，与固体培养基培养相比，间歇浸没式生物反应器培养的植株光合速率高，其叶面积、鲜质量及干质量都明显增加。ARAGO 等[38]选择了间歇浸没式生物反应器培养和半固体培养基培养的芭蕉植株进行移栽驯化，并比较了2 种培养体系的离体叶片解剖结构、离体光合行为和生长情况，结果表明，与半固体培养基培养的植株相比，间歇浸没式生物反应器培养的植株叶片叶绿体和薄壁组织较厚，气孔密度较低，表皮蜡质较多，因此，推测可能是激活了自身的抗氧化防护系统，能够抵御移植环境所带来的威胁；半固体培养基培养的植株叶片叶绿素荧光参数Fv/Fm值始终低于间歇浸没式生物反应器培养的植株；间歇浸没式生物反应器培养的植株移栽后第7 天叶片Fv/Fm 值下降至0.65，之后迅速上升至0.76；而半固体培养基培养的植株叶片Fv/Fm 值在移栽后第7 天下降至0.27，在第35 天缓慢上升至0.68；在离体驯化过程中，间歇浸没式生物反应器植株的光合速率明显高于半固体培养基培养植株；间歇浸没式生物反应器的植株叶面积、鲜质量及干质量均高于半固体培养基的植株。

对移植田中的RITA 培养的香蕉再生植株进行生长调查，发现与传统的组织培养植株相比，在田中生长的初期，植株的茎粗、高度等参数有一定差异，但随着种植时间的延长而逐渐消失[39]。通常，RITA 生物反应器生产的组培苗在移栽后不会发生表型变异，可能与利用RITA 培养植株时所用的植物生长调节剂浓度低和培养周期短等有关[40-41]。

HUGO 等[42]在半固体（SS）培养基、RITA 生物反应器和双瓶式间歇浸没型生物反应器（TIS）中培养油棕鱼雷阶段的体细胞胚，而后评价再生植株在温室中的适应性，结果表明，当体细胞胚在生物反应器中培养大约90 d 后，统计再生植株的数量与质量，TIS 系统培养的生物量积累最大，再生的植株有36% 高于2.5 cm，在温室移栽成活率约为82%，且适应性好，而在SS 和RITA 系统中再生的植株约有15%高于2.5 cm。GAO 等[27]比较了在间歇浸没式生物反应器中培养的荸荠植株和在半固体培养基培养的植株移栽到温室后的生长情况，发现间歇浸没式生物反应器培养的荸荠植株具有较好的适应能力，能产生更多的匍匐根茎（5.0～5.8 根），而半固体培养基培养的植株产生的匍匐根茎要少一些（4.2～4.8 根），意味着间歇浸没式生物反应器培养的植株产量将会增加。

应用间歇浸没式生物反应器培养植株可实现植株的快速繁殖，繁殖效率大大提升，且植株品质明显提高，如玻璃化苗和畸形苗减少，产量增加，抗性增强，适应环境的能力加强，更容易驯化成活。

4 间歇浸没式生物反应器的缺点及其对策

应用间歇浸没式生物反应器进行植物组织培养也存在一定的局限性，如不是所有的植物种类都可以应用该系统；由于培养的时间长，控制不好就会导致全部污染，但诸多研究也在尝试解决污染的方法。

4.1 并不适用所有物种

不同栽培物种对间歇浸没的生长要求各不相同，大多数在间歇式浸没生物反应器的培育中可以生长得很好，但也有一些物种在间歇浸没期间不能生长得很好，反而在持续浸没中生长会更好。FEUSER 等[43]对马铃薯组培苗进行培养后发现，与持续半浸没相比，幼芽在间歇浸没式生物反应器中生长较好，但是芽的连续生长、繁殖发育速度较慢，因此，培养费用相对来说更高。

4.2 污染限制其推广

在单瓶生物反应器进行组织培养过程中发现，采用更大的营养液容器和利用蠕动泵或其他动力机械提供营养，由于污染难以控制而导致失败。现在一般采用双瓶培养，进出营养液均经过严格的无菌化过滤，但培养过程仍未脱离无菌环境，大规模的应用还是会受到污染的限制，如桉树的生物反应器（RITA）培养桉树初代苗污染率就达到100%[44]。

常用的防污方法是消毒外植体后，将抗生素加入到培养基中，抗生素类药剂主要有Plant preservative mixture（PPMTM）、Vitrofural（G-1）和纳米银（silver nanoparticles，AgNPs）等[45-47]。G-1和PPMTM在培养基中可以明显地抑制污染，还会促进植物的生长。试验表明，G-1 能够显著提高培育苗的质量，替代高温灭菌，还节省劳力。PPMTM在多种植物微繁过程中也有应用。崔刚等[48]对葡萄进行了开放性试验，发现抑生剂可以代替高温处理和无菌操作，在不影响植物生长的情况下，将污染限制在10%左右。HVOSLEFEIDE 等[49]研究发现，pH 值的迅速变化可作为植物组织培养是否受污染的标示参数。一般来说，在组织培养初期，pH 值总会下降，因为细胞会首先使用任何铵离子，从而释放H+离子到培养基中。随后，培养基中的铵离子耗尽，细胞代谢将改变为使用硝酸盐离子并释放OH 离子来交换带负电荷的硝酸盐，所以，导致pH 值上升。但在生物反应器中，pH 值会提前开始上升，其原因可能是由于生物反应器中培养物的增长更快。与硝酸盐相比，铵的吸收导致pH 值的降低更快；当细胞开始吸收硝酸盐离子时，铵离子消耗得更快。因此，在间歇浸没式生物反应器中，污染的物质能迅速消耗营养液中的铵离子，从而使pH 值明显上升。MARIEM 等[50]研究发现，添加植物防腐剂混合物能有效控制鞘氨醇单胞菌的繁殖。

4.3 多应用于组培苗

大多数研究主要采用固体培养的组培苗进行间歇浸没式生物反应器的培养，但对细胞和体胚的培养较少，反应器还需要进一步完善和精细化。2005年，ANNE 等[51]对体胚微繁生物器进行了设计试验，对容器内的微环境进行了调整优化，促进了体胚细胞的繁育。

在应用间歇浸没式生物反应器进行植物组织培养时，要选择适宜该系统的植物种类，同时可以探索该系统在细胞培养、原生质体培养及遗传转化体系中的应用。

5 展望

间歇浸没式生物反应器技术是植物组织培养研究的新热点。该技术体系与传统的固体和液体培养方式相比较，显著提高了繁殖效率，节省了成本，通过该技术培养的生根植株在温室驯化和移栽中成活率明显增加，已在多种植物的繁育、突变体筛选等方面应用。目前，RITA 和TIBS 的间歇浸没式生物反应器是应用较为普遍的类型，这2 种系统进一步优化，能更广泛地应用于植物种苗的工厂化生产中。同时在应用该系统进行植物组织培养时，还可以考虑固体培养和生物反应器培养相结合，先利用固体培养基诱导外植体，再将继代苗接种至间歇浸没式生物反应器中进行快速繁殖和生根，这样可以充分发挥间歇浸没式生物反应器的优势。