薏米黄酮类物质组成差异与功能分析

李祥栋 ，陆秀娟 ，潘 虹 ，魏心元 ，杨小雨 ，石 明

（1.黔西南州农业林业科学研究院，贵州 兴义 562400；2.贵州省薏苡工程技术研究中心，贵州 兴义 562400；3.贵州省亚热带作物研究所，贵州 兴义 562400）

薏苡为禾本科薏苡属的1年生或多年生草本植物，其籽粒脱壳之后称为“薏（苡）仁米”或“薏米”，可入馔、入药和酿酒，是典型的药食兼用作物。现代药理学研究表明，薏米不仅含有丰富的营养组分而且富含多类生物活性分子，具有抗肿瘤、降血糖、促进新陈代谢、抑制肿瘤血管生成及提高免疫力、防止皮肤粗糙和美容等多种药理作用[1-3]。黄酮类化合物是一类对植物生长发育和代谢均具有重要作用的次生代谢物，系统分析薏米中黄酮类物质的组成及含量差异，对于薏苡药理学和功能分子挖掘利用均具有重要指导意义。薏苡作为狩猎采集性生产向耕作栽培型农业转型时期的重要作物，在我国的文化和中医药领域均发挥了不可或缺的作用。迄今为止，我国薏苡产业历经超过10 a 的积累和探索，逐步发展为极具区域特色农业产业，主产区主要分布在黔、滇、桂、闽、浙、台等地。基于薏苡的药食同源禀赋，在加工方面薏苡常规食品（米、面、糕等）、功能食品（薏仁面膜、洗发乳等）和药品（抗癌药物）等研发产品也不断涌现。在薏苡药用开发方面，除了传统的中药饮片和药方配伍，以薏苡中性油（薏苡酯）为基础的抗癌药物康莱特注射液的研发和应用最具代表性，它能够阻滞肿瘤细胞有丝分裂，诱导肿瘤细胞凋亡，影响肿瘤细胞基因表达和抗恶病质等作用，对肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞具有极强的杀伤及抑制作用[4]。除了薏苡酯和脂肪酸类，薏苡仁中仍有多种生物活性物质，如甾醇、三萜类、多糖类、氨基酸、维生素、黄酮类等。宝宇翔等[5]以河北小黑壳薏米籽粒为研究对象，采用气相色谱－质谱联用方法对种壳、种皮、带麸皮的红薏米、不带麸皮的白薏米、胚芽5 个部分的代谢物轮廓检测分析，共检出基础代谢物质60 种，包括氨基酸19 种、糖类8 种、脂肪酸及其甲酯和有机酸33 种。前期李祥栋等[6]亦采用广泛靶向代谢组学分析方法对4 个薏米品种萌芽前后的代谢物进行比较分析，发现2 份红皮薏米品种代谢组轮廓类似聚为一类，而2 份黄皮品种则聚为另一类。黄酮类化合物是植物的重要次生代谢物之一，往往与植物抗逆性、颜色、口感及风味的形成等息息相关。目前，在薏苡仁中只鉴定出了槲皮素、山柰酚和芦丁3 种黄酮类组分，但在薏苡仁麸皮中发现多种黄酮单体[7-8]，而且薏苡仁总黄酮具有效清除DPPH 自由基，保护线粒体免受自由基损伤的生理活性[9]。由于目前对于薏苡黄酮组分的鉴定还十分有限，而且不同薏米品种间的累积特征也不清楚。

本研究在前期研究的基础上，采用代谢组学方法对薏苡黄酮及相关功能分子进行定量鉴定和功能分析，并比较不同品种间的组分差异，以期为薏苡优异种质筛选和功能产品的开发利用提供理论和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为8 份具有代表性的栽培薏苡材料，根据种仁麸皮的颜色，分为黄皮品种（YC）和红皮品种（RC）2 种，其中，黄皮类型4 份（安薏1 号、薏珠1 号、薏珠2 号、薏珠4 号）、红皮类型4 份（安国薏苡、日本薏米、薏珠5 号和冀辐19-41），具体材料信息如表1 所示。8 份薏苡材料于2021年4月在贵州省兴义市木贾试验基地按小区种植，小区面积30 m2（6 m×5 m），密度4.0 万株/hm2，除草、施肥等田间管理按照统一方式进行，成熟期收获籽粒、晒干和剥壳，挑选籽粒饱满、完整的糙米以备后续分析。

表1 薏苡品种信息Tab.1 Information of coix cultivars

1.2 试验方法

利用冷冻抽干机对样本进行冷冻干燥，液氮研磨后称100 mg，分别加入300 mL 体积比为2∶2∶1 的甲醇-乙腈-水溶液和10 μL 内标Phenylalanine-d5（质量浓度10 μg/mL），涡旋振荡30 s，低温超声波辅助萃取30 min，2 次；然后-20 ℃放置1 h 沉淀蛋白，过滤；滤液采用12 000 r/min、4 ℃低温离心20 min，取上清冷冻干燥。采用超高效液相色谱和串联质谱（UPLC-MS/MS）方法对薏米类黄酮物质进行代谢组学定量检测，每份样品重复4 次。吸取100 μL 标品溶液向样本中加入200 μL 提取液和10 μL 内标，其余方法按上述样本制备方法来制备标准曲线。

1.3 色谱和质谱条件

液相条件采用色谱柱Waters BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×150 mm，流动相A 相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B 相为乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脱梯度为0～3 min B 相5%～20%，3.0～4.3 min B相为20%，4.3～9.0 min B 相为20%～45%，9.0～11.0 min B 相为45%～98%，11.0～13.0 min B 相为98%，13.1～13.5 min B 相维持在5%；流速0.4 mL/min；柱温4 ℃；进样量2 μL。质谱采用6500 QTRAP 质谱仪（AB SCIEX）在负离子模式下进行质谱分析。6500 QTRAP ESI 源条件如下：source temperature 500 ℃；ion Source Gas1（Gas1）：40；Ion Source Gas2（Gas2）：40；Curtain gas（CUR）：30；ionSapary Voltage Floating（ISVF）-5 500 V；采用多反应监测（MRM）模式检测待测离子对。

1.4 数据分析

采用MultQuant 软件定量分析，采用Excel 2003 进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 薏米黄酮类物质代谢组轮廓

8 份薏米中共检测出17 种黄酮及其衍生物，包括黄酮5 种、异黄酮3 种、黄酮苷5 种和黄烷4 种，其中有11 种在所有样品中均有检出。聚类热图显示（图1），同一品种的不同重复均聚在一起，说明检测结果稳定可靠；除了薏珠2 号单独聚为一支，其余7份薏米品种则聚为2 类，即黄皮品种（YC）和红皮品种（RC）；相同种皮颜色的薏米样品整体表现出相似的代谢组轮廓，暗示种皮颜色可能与黄酮类组分差异相关。

图1 薏米黄酮类物质的代谢组轮廓Fig.1 Metabolome profile of flavonoids in coix seeds

2.2 薏米黄酮及其衍生物的组成特征

由表2 可知，8 份薏米品种的总黄酮含量为192.83～2 214.41 ng/g，平均1 130.62 ng/g，其中冀辐19-41 含量最低，日本薏米含量最高；除了日本薏米外，整体上黄皮品种总黄酮含量高于红皮品种。异槲皮苷、芦丁、圣草酚和木樨草素在总黄酮中的占比相对较高，分别为45.35%、32.77%、6.04% 和5.37%；其余组分占比相对较低，为0.04%～2.27%（图2）。因此，异槲皮苷、芦丁、圣草酚和木樨草素4 种成分为薏米黄酮的主要特征组分，也是薏苡黄酮及其衍生物生理活性的主要物质基础。再者，红皮品种日本薏米的4 种特征组分含量也独具优势，也是薏苡遗传改良和黄酮物质开发利用的重要资源。

表2 薏米黄酮及其衍生物含量Tab.2 Contents of flavonoids and their derivatives in coix seedsng/g

2.3 不同种皮类型薏米黄酮及其衍生物组成与含量差异

在所有检出的黄酮及其衍生物分子中，木樨草素、杨梅素和二氢槲皮素3 种成分仅在黄皮品种中存在，在红皮品种中则基本上未检出；而黄豆黄苷仅在4 个红皮品种中微量存在，含量为2.16～3.09 ng/g，在黄皮品种中则未检出（表2）。异槲皮苷、槲皮素、鹰嘴豆芽素A、柚皮苷、葛根素、木樨草素、牡荆素/异牡荆素、圣草酚和芦丁9 种物质在黄皮和红皮品种中均存在显著差异，与红皮品种相比，异槲皮苷、木樨草素、槲皮素、牡荆素/异牡荆素、圣草酚、柚皮苷和葛根素7 种成分在黄皮品种中表现为显著增加，柚皮素成分则表现为显著减少，柚皮苷、芦丁、7-O-葡萄糖苷木犀草素含量则在黄皮和红皮品种中差异不显著（图3）。综上所述，黄皮品种往往具有更高的黄酮类物质积累，推测可能与不同地区的人为选择和驯化差异有关。

图3 黄皮和红皮类型薏米的黄酮及其衍生物组成差异Fig.3 Components difference in he flavonoids and their derivatives in yellow and red testa coix seeds

2.4 薏米黄酮类分子的药理学功能

根据上述分析结果，对占比最高的4 种成分（异槲皮苷、木樨草素、芦丁和圣草酚）在中药系统药理学数据库TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中进行检索。从表3 可以看出，木樨草素和圣草酚的OB 值和DL 值相对较高（OB≥30，DL≥0.18），说明其口服而被吸收的程度更好，也更具有类药性。根据文献检索，4 种成分均具有抗氧化、抗炎生理活性，甚至具有抗肿瘤、抗细菌和病毒、调节代谢和神经保护等多重生理功效。

表3 薏米主要黄酮类分子的药理学特征Tab.3 Pharmacological characteristics of main flavonoid molecules in coix seeds

3 结论与讨论

薏苡的营养和药用功效是其不可分割的2 个部分，在蛋白质和氨基酸[18]、脂肪酸[19]等主要营养组分评价方面已有诸多报道。李祥栋等[20]在前期也对86 份地方薏苡资源的淀粉、脂肪酸、蛋白质和氨基酸进行分析并筛选优异资源。在薏苡的药用成分方面，脂肪酸及其酯类、甾醇类、酚和醌类、生物碱类、木质素类等多种化合物被鉴定出来[2]。在药物开发方面，则主要以薏苡酯类物质（中性油）为主，也发现了薏苡螺环烃内酰胺A、薏苡螺环烃内酰胺B、薏苡螺环烃内酰胺C、薏苡内酰胺、二氧吲哚-3-醋酸甲酯和薏苡素这些具有抗肿瘤功效的活性分子[21-22]。魏艳梅等[23]从薏苡糠壳中分离出15 种化合物，而且发现香豆酸、2-羟乙基-香豆酸酯、3-羟基-4-甲氧基苯甲酸、1，3，5-三甲基苯和methyl（3-hydroxy-2-oxo-2，3-dihydroindol-3-yl）-acetate 5 种化合物对种子萌发具有抑制作用。黄酮类化合物在植物组织中广泛存在并具有较强的生物活性，而且黄酮类物质的合成往往与植物组织器官的品质、色泽、生长发育、紫外保护和生物胁迫等生理过程息息相关。已有研究表明，红花通过C-葡萄糖基醌查尔酮的合成调控赋予其白色、黄色、浅红色和深红色不同的颜色特征[24]；也有学者在红、白、黑、黄不同颜色的藜麦品种中检测到了17 个类黄酮相关的代谢物并揭示了其合成调控机制[25]；另外，对不同颜色糜子的抗氧化性研究发现，有色糜子的抗氧化活性均高于白色糜子，而且很可能是酚酸和黄酮物质导致其抗氧化活性的差异[26]。本研究也表明，除了日本薏米外，黄皮薏米的总黄酮含量整体上高于红皮薏米，而且在12 个黄酮差异代谢物中7 个显著增加、1 个显著减少；薏米种皮颜色相同的品种整体上表现出相似的代谢组轮廓。除个别品种外，黄皮品种黄酮物质含量比红皮品种更高，揭示出黄皮品种比大多数红皮品种在黄酮种类和含量方面更具优势，推测这种品种间黄酮含量差异形成可能与不同地区的选择驯化和生物适应性相关。尽管如此，有关薏苡黄酮和其他生物活性分子的合成机制仍然知之甚少。本研究发现，异槲皮苷、芦丁、圣草酚和木樨草素4 种成分为薏米黄酮的主要特征组分，在诸多报道中均表现出抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗细菌和病毒、调节代谢和神经保护等多种生理活性。因此，通过基因组学和代谢组学等多组学技术深入解析薏苡包括黄酮在内药用分子的合成代谢机理并挖掘其药理学功能，也是薏苡高值化产品开发和利用的重要内容。