产单核细胞李斯特菌分子分型技术的最新研究进展

李文静，刘凌云，解 媛，史 简，李 雪，陆书华

（1.济宁医学院临床医学院，山东济宁 272067；2.济宁医学院附属医院检验科，山东济宁 272000）

产单核细胞李斯特菌(ListeriaMonocytogenes，LM)，是一种食源性致病菌，广泛存在于自然界中，食用受该菌污染的食物可导致人类感染并可能引起严重的李斯特菌病，该病主要发生在某些特定人群中，如孕妇、新生儿、免疫功能低下者和患有基础疾病的老年人，临床表现为脑膜炎、败血症、胎儿早产、孕妇流产，甚至导致人类死亡，该病死亡率高达20%～30%[1-2]。李斯特菌病潜伏期长达70天，这使得追踪其流行病学来源变得十分困难[3]。近年来，分子分型技术作为李斯特菌病流行病学调查的重要工具，在明确LM致病性、遗传相关性、追踪污染源、确定传播途径、控制疫情暴发等方面具有重要意义。通过对LM分离株进行分子分型可以建立临床病例和可疑食物之间的联系，有利于污染源的追踪。目前，LM分子分型技术主要包括两大类，一类是基于电泳的分型技术，另一类是基于测序的分型技术。本文就LM分子分型技术的最新研究进展进行详细综述。

1 基于电泳的分型技术

1.1 脉冲场凝胶电泳( pulsed-field gel electrophoresis，PFGE) PFGE最早是由哥伦比亚大学的SCHWARTZ和CANTOR于1984年开发的一种用于分离大分子DNA或染色体的方法。该方法灵敏度高、分辨率强、重复性好，在国内外得到广泛应用，特别是在菌株鉴定和追踪污染源方面发挥了重要作用，被认为是细菌分子分型的金标准[4]。PFGE的基本原理是基于酶切产生的大小不等的DNA片段在脉冲电场中迁移速率的不同将DNA片段分离，经溴化乙锭（EtBr，EB）染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳条带，根据可视化条带的差异进行菌株型别的判断。PAŽIN等[5]人使用限制性核酸内切酶APAI对香肠中分离出的10株LM进行脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）分型，结果显示所有菌株的电泳图谱之间无条带差异，菌株亚型无法区分。SHAKUNTALA等[6]人联合使用APAI酶和ASCI酶对印度东北部收集的47株动物源性LM分离株进行PFGE分析，共发现37种脉冲型，并指出双酶切的使用可以大幅度地提高PFGE对LM亚型的区分度。尽管PFGE是LM分子分型的金标准，但它所需的专业设备昂贵、耗时耗力、对人员要求高、对条带的解释带有主观性、结果分析需要采用专门的软件，所以在临床中未被广泛应用，主要应用于科研及食品中LM的分型。

1.2 核糖体分型（ribotyping，RT） RT是基于编码核糖体的高度保守的基因序列，用标记的大肠埃希菌rRNA探针与限制性内切酶切割LM全基因组所产生的DNA片段进行Southern杂交而获得带型差异的一种分子指纹技术[7]。该技术灵敏度高、重复性好，但需要用到放射性同位素、实验步骤繁琐、分辨力一般，不能有效区分1/2b和4b型菌株。目前，国际上已有完全自动化的微生物基因指纹鉴定系统（automated ribotyping，AR)，它是基于RT原理，经灭活、酶切、杂交、成像等自动化程序，对细菌核糖体进行指纹图谱分析的自动化设备。DE CESARE等[8]人基于AR研究了15种不同的酶对LM菌株鉴别的适用性，发现使用EcoRI，PvuII和XhoI三种限制性内切酶不仅对LM菌株有较高的鉴别力，而且可以显著提高4b型菌株的区分度。AR排除了人为因素对实验结果的影响，操作简单、省时省力、高度标准化、重复性好、结果稳定，但由于AR分辨率较低，故其在菌株鉴定和分子分型方面的应用受限，适于大样本量菌株的初步研究[9]。

1.3 扩增片段长度多态性 (amplified fragment length polymorphism，AFLP) AFLP又称选择性限制片段扩增,它是限制性酶切产物经PCR扩增和电泳后得到不同分子量大小的DNA条带，通过比较DNA条带的差异来检测DNA多态性的一种技术[10]。目前，国外学者关于AFLP在病原微生物方面的研究比较广泛，国内尚不多见。LOMONACO等[11]人利用AFLP技术对环境及食品中的108株LM进行分析，结果显示AFLP可将LM菌株分成两个遗传谱系，包括谱系I（血清型1/2b，4b，3b)和谱系II(血清型1/2a，1/2c，3a)。FONNESBECH VOGEL等[12]人指出，AFLP技术能够区分LM和其他李斯特菌种，并对96株LM进行了分型，主要分为2个簇，相似度为82%。其中，I簇包括32种AFLP类型，II簇包括13种AFLP类型，其余为其他李斯特菌种和反硝化菌株。AFLP技术不仅具有重复性好、灵敏度高、分辨率高、DNA用量少等优势，还可以揭示菌株之间的进化关系，适于基因组同源性高的生物群的研究，但由于引物需要同位素标记，对样品DNA质量要求严格、制备和进行凝胶电泳所需时间长以及对带型的解释和分析带有主观性而受到一定的限制。

1.4 限制性片段长度多态性（restrictionfragment length polymorphism，RFLP） RFLP是一种利用限制性内切酶特异性识别双链DNA的某一段序列，并在特定位置进行DNA双链切割，进而产生长度大小不等的限制性片段，经电泳、转膜后，比较DNA多态性的基因分型技术[13]。RIP等[14]人针对LM设计了一种基于hly基因的PCR-RFLP新方法，该方法可将LM区分为三个谱系组：谱系Ⅰ（血清型1/2b，3b，4b，4d，4e和7）、谱系Ⅱ（血清型1/2a，1/2c，3a和3c）和谱系III（血清型4a和4c），并用其他方法验证了PCR-RFLP方法的有效性和可靠性，认为该法可作为LM血清型谱系组分类的一种替代方法。RFLP技术操作简单、无需探针标记、实验设备比较普及、成本低、不依赖自动化设备，但通量低、部分结果不容易判断，适于硬性条件不好的实验室进行低通量的分子检测。

1.5 多位点串联重复序列分型(multilocus variable number of tandem repeat analysis，MLVA) MLVA是通过检测基因组中特定位点上串联重复序列可变拷贝数之间的差异来推断菌株间遗传进化关系的一种分子分型技术[15]。近年来，MLVA已被广泛应用于LM菌株分型。MARTÍN等[16]采用MLVA对从肉制品和肉制品加工厂中分离的113株LM进行分型，共获得27个不同的MLVA谱，Simpson多样性指数为0.907，证实了MLVA是鉴别LM菌株的一种常用的、快速的、可靠的亚型分型方法。MIYA等[17]通过比较MLVA，MLST，PFGE和Ribotyping，发现这四种技术鉴别能力大小排序为：MLVA＞PFGE＞MLST＞Ribotyping，其中，MLVA对4b型菌株的鉴别能力最高，它可将4b型菌株分为三组(ECI，ECIa和ECII)，结果更容易解释。MLVA只需常规的PCR和标准的琼脂糖凝胶电泳即可完成，结果可在DNA提取后不到8h内获得，具有简便、快速、经济、高通量、重复性好、分辨率高等优点，不仅能确定基因多态性，而且能揭示菌株群体遗传的结构特征，可作为减轻PFGE工作量的一种有用的筛选方法。此外，该技术将检测结果数字化，减少了在结果分析过程中的主观因素，便于不同实验室间结果的比较[18]。

1.6 随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD) RAPD又称任意引物PCR，是由WILLIAMS和WELSH于1990年首次提出并发展起来的一项新的遗传标记技术，该技术[19]是以PCR为基础，利用随机合成的寡核苷酸片段作为引物,在低退火温度下扩增目的基因组DNA，经凝胶电泳分离，分析扩增产物DNA片段多态性的一种分子生物技术。BYUN等[20]人为了解进口或国产肉类中LM的流行病学特点，利用RAPD技术对54株LM分离株进行分子流行病学研究，发现用三种引物组合可将LM分为40个类型，并且证实了韩国与美国牛肉分离株、韩国与丹麦猪肉分离株之间的亲缘关系，上述结果表明，RAPD不仅可作为LM流行病学研究中一种有效的分型工具，还可以揭示LM菌株间的遗传进化关系。该技术简单、快速、灵敏、成本低、DNA用量少，结果易于解释，但由于它采用的是随机引物扩增并使用了较低的退火温度，故它的稳定性及重复性较差，可用于少量菌株的快速分型及流行病学追踪。

2 基于测序的分型技术

2.1 多位点序列分型( multilocus sequence typing，MLST) MLST是参照法国巴斯德研究所的产单核细胞李斯特菌MLST数据库（http://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html）操作流程，对7个管家基因（abcZ，bglA，cat，dapE，dat，ldh，hkA）PCR扩增片段进行测序和序列比对分析，确定其序列类型（sequence type，ST）的一种方法[21]。LU等[22]人对2008～2019年从中国患者的血液、脑脊液、胎膜、胎盘等标本中分离出的144株LM进行MLST分型研究，发现所有菌株被分为23个ST型，ST87(49株，34.0%)最常见，其次为ST1(18株，12.5%)，ST8(10株，6.9%)，ST619(9株，6.3%)，ST7(7株，4.9%)和ST3(7株，4.9%)。ZHANG等[23]人使用MLST技术对2014～2018年中国北京从临床感染病例中分离出的120株LM进行分型分析，所有菌株被分为25个ST型，ST8最常见，其次是ST87和ST5。CHEN等[24]人利用MLST技术对中国43个代表性城市新鲜蔬菜中分离出的30株LM进行研究，30株LM被分为9个ST型，其中ST87和ST8占优势。CHEN等[25]人报道从中国即食食品和巴氏杀菌乳中分离出的48株LM亦以ST87和ST8为主。综上所述，ST87，ST8和ST5在中国食品和临床分离菌中占优势，是引起中国人类李斯特菌病的主要序列型。然而，国外最常见和报道最广泛的序列型是ST1和ST9[26]。加强上述常见ST型的长期监测不仅有利于李斯特菌病的预防与控制，还可以揭示LM菌株的种群结构，从广泛的地理、时间和流行病学来源推断菌株之间的进化关系。MLST是一种成熟的、国际通用的、基于群体的菌株分化技术，该技术特异性强、分辨率高、实验结果可在不同的实验室间共享。与PFGE相比，MLST更具鉴别力，能够进一步区分PFGE无法区分的类型，被广泛应用于LM的流行病学调查和暴发期间特异性菌株的来源追踪。

2.2 多毒力位点序列分型(multi-virulence-locus sequence typing，MVLST) MVLST是一种基于MLST用进化较快的毒力和毒力相关基因（prfA，inlB，inlC，dal，clpP和lisR）代替管家基因对病原微生物进行分型的一种新技术。ZHANG等[27]人利用LM的3个毒力基因(prfA，inlB，inlC)和3个毒力相关基因(dal，lisR，clpP)对28株LM进行MVLST分析，发现与MLST相比，MVLST对血清型1/2a和4b的鉴别力更高。ZHANG等[28]人利用MVLST技术对从中国食品中分离出的73株LM进行分析，共确定了18个毒力型，31.5%的分离株属于流行克隆，包括ECI，ECIV，ECV，ECVI，ECVIII和ECXI，其中以ECV为主。KIM等[29]人对2002～2014年从美国奶牛场中分离出的121株LM进行MVLST分析，共鉴定出59个毒力型，25%的分离株被确定为流行克隆。LM在国内外广泛流行，相关部门应加强对食品卫生的管理与监督，尽量避免人类因食用受污染的食物而感染LM。MVLST鉴别能力高，分型能力强，适用于当地毒力和毒力相关基因进化更快的菌株的流行病学研究。

2.3 全基因组测序（whole genome sequencing，WGS） WGS是在基因水平上对病原菌进行测序并分析其遗传信息的一种新兴技术。WGS作为一种流行病学工具不仅可以识别高度相关的LM，而且还可以用来检测与高毒力或特定致病模式相关的毒力岛的存在，在了解LM的遗传变异、地理起源、进化状况、未来监测方向、风险评估以及追踪溯源等方面发挥了重要作用，越来越多地被应用于疫情的检测和调查。GUIDI等[30]人使用WGS方法对屠宰场中分离出的122株LM进行研究，共检出5个CCs: CC1-ST1(21.3%)，CC6-ST6(22.9%)，CC9-ST9(44.2%)，CC121-ST121(10.6%)和CC193-ST193(0.8%)，其中，CC9和CC121被定义为低毒性克隆，CC1和CC6被定义为高毒性克隆，并发现高毒性克隆CC1和CC6屠宰场中存在的时间更长，这些发现表明，高毒性LM克隆存在严重的食品污染风险，与人类李斯特菌病相关。LI等[31]人应用WGS技术对中国11个省份2013～2019年收集的360株LM临床分离株进行遗传多样性分析，共检出25个CCs，其中CC87，CC8和CC5是引起人类李斯特菌病的常见克隆复合体，此外，他们还发现所有临床分离株LIPI-1，LIPI-3和LIPI-4均为阳性，且LIPI-4阳性菌株中的CC87，ST619，ST382，CC4和CC2已被证明具有高毒力。YIN等[32]人利用WGS分析中国侵袭性李斯特菌病病例中LM分离株的遗传多样性，发现ST87在中国占优势，系统发育树显示从临床病例和零售食品中分离出的ST87亲缘关系十分密切，这说明人类感染李斯特菌很有可能是由食品传播给人类的，因此，我们应多关注ST87的毒力因素及致病机理，为李斯特菌病的控制和预防打下坚实基础。WGS具有高度鉴别力，对LM流行菌株的检测和分析更加准确，现已成为LM分子分型的新的金标准。尽管WGS在疫情调查中具有优势，但由于基础设施和资源的不足，对许多国家来说，WGS的广泛应用仍然具有挑战性。

3 分子血清分型

除以上两大类分子分型技术外，分子血清分型( molecular serotyping)也是一种经典的区分LM的方法。分子血清分型[34]是利用多重PCR扩增LM血清型目标基因lmo0737，lmo1118，ORF2819，ORF2110和prs，从而对LM进行血清型分型的一种技术。目前，LM已鉴定出14种血清型，其中1/2a，1/2b和4b型与96%以上的人类李斯特菌病有关，1/2a在食物中常见，4b在临床分离株中常见[33]。SHEN等[35]人利用分子血清分型技术对中国2018～2020年食品中检测出的81株LM进行分析，研究发现1/2a占优势，分离物以猪肉为主，这与世界范围内之前所报道的一致。VALLEJO等[36]人利用分子血清分型技术对西班牙北部某地区2010～2020年从临床样本中分离出的111株LM进行研究，结果显示4b在临床感染病例中最常见(53.2%，59株)，其次是1/2b(27%，30株)，1/2a(18.9%，21株)和1/2c(1株)，该数据更加印证了4b在临床分离株中常见这一结论。分子血清分型是最常用和使用最广泛的分型技术，该技术简单、快速、重复性较好，特别适合于疫情暴发时的快速检测和李斯特菌病的长期监测。

4 总结与展望

产单核细胞李斯特菌(LM)作为一种食源性致病菌，严重威胁人类的生命健康。分子分型技术作为食源性疾病流行病学调查的重要工具必不可少，上述分型技术各有利弊，在实际应用中，可根据实验室条件及研究需求选择一种或联合使用多种分型技术。理想的分型技术应该具有快速、准确、灵敏度强、特异度高、重复性好的特点，WGS对LM遗传相似的分离株的区分度更高，已成为LM分子分型的新的金标准，未来随着测序成本的下降，WGS有可能取代其它分型技术成为细菌分子分型的有力工具，为细菌的致病性、耐药机制、流行病学监测提供有效依据。