整合应激反应在呼吸系统疾病中的作用

卓怀蜜 陈宋程 周向东,2 李琪,2

整合应激反应(integrated stress response,ISR)广泛存在于真核细胞体内，是维护细胞内稳态和细胞生存的重要适应性机制，可被多种细胞应激和病理条件激活，如内质网应激、氧化应激、DNA损伤、营养物质缺乏等[1-2]。该过程主要通过磷酸化真核生物起始因子2(phosphorylation of eukaryotic translation initiationfactor 2，p-eIF2)α亚基中的丝氨酸-51位点，阻断鸟嘌呤核苷酸交换因子(The guanine nucleotide exchange factor)eIF2B的作用，抑制细胞内翻译，减少蛋白质的总体合成，并激活下游转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)调控相关应激基因，如CHOP、GADD34等的表达参与氨基酸代谢、未折叠蛋白反应、细胞凋亡等过程[3-4]。这一机制依赖于四种不同的eIF2α激酶：蛋白激酶R样内质网激酶(PKR-like ER kinase，PERK)、一般控制非抑制因子2(general control non-depressible protein 2，GCN2)、RNA依赖性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)、血红素调节的eIF2α激酶(heme-regulated eIF2a kinase，HRI)，每种激酶感知和响应不同的应激源[4]。PERK是位于内质网膜上的I型跨膜蛋白激酶，对内质网应激具有较高的敏感性。PERK可以通过整合内质网应激另两条信号途径：需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme-1，IRE1)和转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)途径，参与调控蛋白质合成、降解、细胞自噬与凋亡[5]；GCN2能使细胞对氨基酸缺乏做出反应，降低细胞对氨基酸的消耗，同时在营养不良的环境中将资源转化为氨基酸的生物合成[6]；PKR主要参与细胞内抗病毒反应，阻断胞内病毒的复制及蛋白合成[7]；HRI被认为主要存在于红细胞体内，在血红素浓度低下或铁缺乏时被激活，调节血红素与珠蛋白之间的平衡[8]。目前人们发现蛋白激酶并不仅仅只是被特定的一种应激源所激活，而是能感应不同应激诱发ISR，且不同蛋白激酶反应之间往往存在协同交互作用[9]。

近些年来，随着对ISR研究的深入，人们发现ISR不仅仅只是细胞保护反应机制，其还参与了多种疾病的发生发展，研究发现，衰老及与年龄相关的疾病通常与ISR的激活有关[10]，且通过调节ISR可以逆转蛋白质稳态缺陷导致的各种记忆、认知功能障碍和神经退行性变[11]。而在心肌梗死中，ISR激活可保护心肌细胞免受再灌注损伤[12]。但在慢性主动脉缩窄诱导的GCN2、PKR信号通路中，ISR的激活则会进一步加重心脏功能的衰竭[13]。此外，ISR还与肝脂肪变性和糖尿病等代谢性疾病密切相关[14]。随着ISR在呼吸系统疾病中的作用被逐渐认识到，它在呼吸系统中显示出更加重要的作用。故本文主要就ISR在呼吸系统疾病中的作用机制作一综述，对象主要包括非小细胞肺癌(NSCLC)、肺结核(TB)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘、特发性肺纤维化(IPF)、阻塞性呼吸暂停综合征(OSA)。

一、ISR在呼吸系统疾病中的作用

(一)非小细胞肺癌(NSCLC)

靶向治疗已成为目前治疗NSCLC的一种有效方法，但近年来人们发现，许多NSCLC患者开始出现耐药性[15]，寻找新的靶向治疗点成为必然。PD-L1/PD-1是体内重要的免疫调节因子，在肺癌细胞中可以检测到PD-L1的高表达，PD-L1通过结合T细胞膜上PD-1受体，抑制T细胞增殖，从而使肿瘤细胞躲避宿主免疫系统攻击[16]。Suresh[17]等人通过对人非小细胞肺癌 H358细胞进行全基因组CRISPR/Cas9筛选发现，在尿卟啉原脱羧酶(uroporphyrinogen decarboxylase，UROD)缺失的NSCLC细胞中PD-L1蛋白的表达增加，且UROD是血红素合成的关键酶。实验发现，血红素缺乏通过活化HRI/eIF2α途径激活ISR，ISR的激活促进了PD-L1的依赖性翻译，从而抑制CD8+T细胞介导的宿主免疫反应，促进了肺癌细胞的生长。

此外，肿瘤微环境一般被认为处于营养物质缺乏状态。为了抑制营养物质缺乏激活的细胞应激反应诱导的细胞凋亡，肿瘤细胞必须利用不同的适应性反应来躲避[18]。那么肿瘤细胞是如何逃避的呢？研究发现，在氨基酸缺乏时，KRAS基因突变的NSCLC细胞通过激活转录因子ATF4通路靶向调控天冬酰胺合成酶(asparaginesynthetase，ASNS)，ASNS通过调控细胞周期调节蛋白cycling B1促进肿瘤细胞的增殖,GCN2-eIF2α信号途径协同参与此过程[19-20]。Ghaddar[21]等人近来的研究则进一步明确了ISR在KRAS突变的肺腺癌细胞中的作用。实验表明，PERK/p-eIF2α臂通过抑制细胞内双特异性磷酸酶6(dual specificity phosphatase 6，DUSP6)的翻译，增加细胞外信号调节激酶(the extracellular signal-regulated kinase，ERK)的磷酸化表达以促进应激反应下肿瘤细胞的存活和生长。DUSP6在人类肺腺癌细胞(lung adenocarcinoma cell,LUAD)中表现出抗肿瘤作用，其低表达与LUAD对丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)抑制的敏感性增加和预后不良有关,这是KRAS突变肿瘤发生的重要机制。而该研究结果与临床收集到的928例原发性肺腺癌患者的数据分析结果一致。与p-eIF2α阴性的患者相比，p-eIF2α阳性患者的预后更差，且p-eIF2α的表达增加与肿瘤局部侵袭性、肿瘤亚型和肿瘤细胞增殖相关。在肿瘤浸润区域，p-eIF2α表达更高。因此，通过使用PERK抑制剂或ISR抑制剂阻断p-eIF2α翻译，可增加DUSP6的表达，降低ERK磷酸化，同时下调ATF4来抑制肿瘤细胞增殖。

(二)肺结核

结核肉芽肿是结核病主要的病理特征表现，它的形成使得结核杆菌得以逃避机体免疫清除，从而进一步传播[22]。目前已证实，肿瘤坏死因子(TNF)是结核肉芽肿形成和维持以及结核耐药性的重要细胞因子，且研究发现，结核分枝杆菌毒力的增强和宿主对结核分枝杆菌的高易感性都与I型干扰素刺激基因(IFN-I-stimulated genes，ISG)的表达增加有关[23]。在结核病临床诊断前18个月，感染结核分枝杆菌的潜伏结核病患者外周血中，可检测到ISG表达上调，这表明ISG可能是活动性结核的预测因子，且IFN-I途径可能与活动性结核的发病和疾病的严重程度密切相关[24-25]。此外，研究发现，在肺结核患者的坏死性肉芽肿中，可检测到ISR标记物表达强烈上调，特别是在靠近结核肉芽肿坏死中心的细胞层[26]。

近来，Bhattacharya[27]等人发现携带sst1易感(sst1S)基因型的小鼠在结核分枝杆菌感染后易出现坏死性结核肉芽肿，这与巨噬细胞对TNF的异常反应和持续升高的应激反应有关。sst1S巨噬细胞在TNF的持续性刺激下，早期反复诱导IFN-I途径激活、叠加，在中晚期，结合内源性胞质PKR配体活化PKR信号通路，诱导eIF2α磷酸化触发ISR而后续激活ISR相关转录因子的表达，如ATF3、CHOP、TRB3和DDIT4，从而引起巨噬细胞死亡和组织坏死，导致机体免疫功能受损，这可能与结核病活动性进展有关。因此，通过特异性阻断TNF介导的IFN-I和ISR反应，将有可能成为治疗结核病中坏死性肉芽肿的有效手段。

(三)慢性阻塞性肺疾病(COPD)和哮喘

慢阻肺特征性病理表现为肺气肿和慢性气道炎症。目前已知香烟暴露(cigarette smoking exposure，CSE)和由此产生的氧化应激是COPD发展的主要因素之一，相关研究已经证明氧化应激通常可以诱导内质网应激，两者相互作用促进疾病进展[28]。香烟烟雾所致的氧化应激可抑制内质网相关蛋白降解途径(endoplasmic-reticulum-associated protein degradation，ERAD)中蛋白酶的活性及细胞自噬，导致错误折叠蛋白与未折叠蛋白大量积累，加剧了侵袭性小体形成，是导致COPD肺气肿形成和进展的重要机制之一，而该过程与eIF2α磷酸化水平变化有关[29]。与未暴露于香烟烟雾的小鼠相比，暴露于香烟烟雾的小鼠肺裂解物中磷酸化eIF2α的表达增加了4倍[30]。在小鼠CSE诱导的急性模型中可检测到PERK/eIF2α信号通路的表达，而在COPD严重肺气肿患者中也发现磷酸化eIF2α的表达上调[31]。支气管气道上皮细胞的基因表达谱研究表明，在患有和不患有COPD的目前和以前的吸烟者中，ATF4介导的COPD相关病理改变的基因表达显著增加[32]。因此，阻断ATF4介导的细胞凋亡通路可能是降低气道疾病发病的方法。

Emily及其同事发现一个有趣的现象，在利用铜绿假单胞菌感染支气管上皮细胞时发现，铜绿假单胞菌分泌的绿脓杆菌素和碱性蛋白酶除了介导内质网应激反应之外，这两种毒素还对铁具有高敏感性，铁缺乏，将平行独立于内质网应激途径激活HRI激酶触发ISR，ISR通过翻译转录因子ATF4诱导GADD34蛋白合成增加，GADD34的表达降低了细胞毒性并提高了细胞存活率，保护宿主免受铜绿假单胞菌的毒性作用，这意味着在慢性肺部疾病细菌感染期间，独立于内质网应激反应的ISR可能会提供一个潜在的治疗靶点[33]。

关于ISR在哮喘中的研究极少，目前研究发现哮喘患者，血单核细胞和肺泡巨噬细胞中发现CHOP的诱导，而小鼠和细胞内磷酸化eIF2α的表达增加，这提示ISR可能参与了哮喘的发病，但具体机制仍不清楚[34]。

(四)特发性肺纤维化(IPF)

IPF是一种病因未明、病死率较高的间质性肺疾病，目前认为IPF的发病与肺泡上皮细胞发生反复损伤后的异常修复及持续的成纤维细胞活化、胶原和基质沉积有关。研究发现，长期暴露在高危因素，如吸烟、粉尘、生物燃料等刺激下可激活ISR。ISR通过活化PERK/eIF2α/ATF4信号诱导CHOP蛋白表达，介导Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡，导致上皮屏障再生修复不足，残存细胞发生上皮-间充质样转化，大量促纤维化因子的分泌，使成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，引起细胞外大量基质沉积[34]。Burman[35]等人建立博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型，通过模拟局部缺氧环境并通过敲除小鼠CHOP基因证实，在缺氧的环境下，CHOP蛋白的表达能促进Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar type 2 pneumocytes，AT2)的凋亡而加重肺纤维化。此外，CHOP可诱导巨噬细胞向M2型亚群分化，进一步促进肺纤维化形成。Anthea[36]等人在肺损伤后修复期，发现了一种肥大、多倍体的AT2细胞。这种AT2细胞是AT2干细胞向AT1细胞分化过程中由于胞质分裂失败产生的一种双核型细胞。过多的多倍体AT2细胞将导致AT2干细胞子代的缺失，减弱其再生能力，影响肺损伤后修复。通过对受损的肺组织进行单细胞RNA测序分析显示，AT2细胞向AT1细胞分化过程中表达与ISR相关的基因，且肺损伤在AT2细胞分裂、扩大和分化修复肺泡上皮时持续激活ISR，增加了多倍体AT2细胞胞质分裂失败的易感性。在SARS-CoV-2肺炎引起的严重肺损伤患者当中，一些患者会发展为持续性、进行性的肺纤维化，在他们的肺组织中也发现了类似的细胞。因此，通过减弱肥大、多倍体肺泡上皮细胞的形成或持续时间有利于维持AT2细胞的再生能力及促进肺修复。

(五)阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSA)

关于ISR在OSA中的研究甚少，目前研究发现ISR与OSA导致的代谢功能障碍有关。OSA以慢性间歇性缺氧(intermittent hypoxia，IH)为特征，一方面，IH不仅可诱导氧化应激激活ISR，触发大量炎症因子释放，如IL-1、IL-6、IL-13等，导致炎症反应，且可诱导体内白色脂肪组织(WAT)分解产生游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)，FFA可激活PERK依赖性转录因子IKK(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)加重细胞炎症反应。另一方面，FFA大量产生，进一步激活PERK信号通路，诱导CHOP蛋白表达，介导胰岛B细胞凋亡，并通过整合IRE1/XBP1s通路，激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)、NF-κB等，共同导致胰岛素信号通路受损，引起胰岛素抵抗[37-38]。Khalyfa[39]等人发现，OSA小鼠体内，IH可持续性激活并延长ISR周期。慢性ISR持续性激活PERK信号，加重脂肪炎症反应和胰岛素抵抗，引起糖尿病、血脂异常等并发症的发生。

二、ISR药物

目前已有针对ISR的药物，包括激动剂和抑制剂。ISR抑制剂包括eIF2α激酶抑制剂和ISRIB(Integrated stress response inhibitor)，是治疗神经退行性病变、肿瘤及代谢性疾病的重要手段。相关研究显示，ISR抑制剂在治疗与应激颗粒(Stress Granuals，SGs)形成有关的神经退行性病变方面具有神经保护作用[40]。在呼吸系统方面，目前已明确选择性PERK抑制剂GSK2606414和ISRIB能有效抑制小鼠肺腺癌细胞的增殖，具有抗肿瘤活性，且ISRIB在长期治疗中，能持续性抑制ISR，并无明显毒性副作用[21]。而选择性PERK抑制剂GSK2656157似乎能通过阻断血管生成来抑制体内癌症的生长[42]。ISRIB还可抑制小鼠体内结核分枝杆菌增殖和肉芽肿形成，改善小鼠肺部炎症和坏死程度[27]。此外，ISRIB能减少多倍体AT2细胞的形成或持续时间，促进肺纤维化小鼠AT2细胞向AT1细胞正确分化，加速上皮修复，减少促纤维化巨噬细胞的募集，改善肺纤维化[11,37]。

ISR激动剂主要是通过激活eIF2α激酶或抑制eIF2α去磷酸化来实现，包括eIF2α激酶激动剂及磷酸酶抑制剂。eIF2α激酶激动剂可应用于抗耐药癌症的治疗，如选择性PERK激活剂CCT020312，其可通过激活G1/S细胞周期点，增加肿瘤细胞对化疗的敏感性[43]。而磷酸酶抑制剂，如沙鲁布林，研究发现其在缺血性疾病中具有保护作用[44]。此外，沙鲁布林可保护气道上皮细胞免受香烟诱导的凋亡和抑制气道上皮内质网应激，保护小鼠免受肺气肿的发展，是治疗COPD的潜在新方法[45]。Sephin1是胍那苄衍生物，可选择性抑制GADD34蛋白。研究显示，Sephin1可抑制呼吸道合胞病毒(RSV)和人类肠道病毒(EV-D68)复制，但治疗所需剂量过高，较易产生严重毒性反应，当前尚未进入临床研究[42]。奈非那韦是临床使用的一种抗HIV药物，目前尚未明确其介导eIF2a磷酸化增加，从而激活ISR的确切作用机制[1]。

三、结语与展望

自David Ron[46]等人首次提出“整合应激反应(ISR)”这一概念以来，人们对于ISR在细胞内的作用及与人类疾病关系的研究从未停止。目前许多研究已明确ISR与肺部疾病的相关性，大量实验结果也凸显了ISR在肺部疾病中的重要性。因此，以ISR激酶及其下游信号为靶点进行干预，可能有助于延缓疾病进展和改善临床结果。但在此之前需要解决一些问题，我们需要考虑这些靶点和信号通路的稳态活性，并在使用时进行观察和不断调整，以便更明确地掌握它们对治疗发展的影响。此外，细胞在不同应激源刺激下针对不同ISR激酶作用进行反应调整，ISR信号在不同类型细胞之间的交叉、重叠，可能影响疾病的发病过程，这些需要进一步的研究来阐明并确定。