坏死性凋亡在慢性阻塞性肺疾病中的研究进展

刘佳丽 赵卉

慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)是一种常见的气道炎症性疾病，通常指由于长期暴露于有毒颗粒或气体，导致不可逆的气道重塑和肺泡破坏，引起慢性支气管炎和肺气肿[1]，是全球第三大死亡原因[2]。慢阻肺是一种具有多种分子致病机制的复杂疾病，与氧化应激，气道炎症，蛋白酶/抗蛋白酶失衡，自身抗体产生，细胞衰老和细胞死亡等有关。炎症反应和细胞死亡是慢阻肺最重要的致病因素[3]。坏死性凋亡是一种由受体相互作用蛋白激酶(RIPK1、RIPK3)和混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)介导的新型非凋亡性细胞死亡形式，细胞发生坏死性凋亡后可产生很多的炎症物质，导致持续的炎症反应。最新研究表明坏死性凋亡在慢阻肺的发病机制中起着重要的作用[4-5]，且抑制坏死性凋亡信号通路，可缓解香烟烟雾暴露引发的肺部炎症及气道重塑，有望成为治疗慢阻肺的潜在新靶点。因此，明确坏死性凋亡在慢阻肺发病机制中的作用，具有一定的理论及临床指导意义。

一、坏死性凋亡的概述

程序性细胞死亡是多细胞生物组织中消除受损、感染或衰老细胞，维持正常发育和稳态的关键过程，在人体病理生理学中具有重要作用[6]。细胞凋亡为程序性细胞死亡的主要形式，由半胱天冬酶家族蛋白质(Caspase)执行，可消除体内不必要和有害的细胞，包括病毒感染的细胞，衰老细胞和癌细胞等[7]；与细胞凋亡不同，坏死性凋亡是一种非Caspase依赖的，可驱动组织炎症和坏死的程序性细胞死亡形式，它是一种溶解性死亡，通过破坏质膜的完整性使细胞内容物溢出到细胞外环境中，促进炎症反应[5, 8]。先前的研究证实了坏死性凋亡在急性肾损伤、骨关节炎、心血管疾病、视网膜变性、颅内损伤、肝损伤和脓毒性休克等疾病中的潜在作用，最近多项研究强调了其在慢性阻塞性肺疾病中起着不可或缺的作用[9-10]。

二、坏死性凋亡的分子调节机制

坏死性凋亡由一类死亡受体诱导发生[11]，包括肿瘤坏死因子受体(TNFR1、TNFR2)、干扰素受体(IFNR)、Toll样受体(TLR3、TLR4)、干扰素调节因子(DAI)的DNA依赖性激活剂、以及细胞内RNA或DNA感受器等[12-13]。这些死亡受体与各自的配体结合后被激活，促使细胞沿着坏死性凋亡途径向下移动。

其中研究最为广泛的是TNF-α/TNFR1诱导途径，首先TNF-α与TNFR1结合，TNFR1被激活后与RIPK1、肿瘤坏死因子受体1型相关死亡域蛋白(TRADD)、FADD、E3泛素化连接酶、肿瘤坏死因子受体相关因子2/5(TRAF2/5)及细胞凋亡蛋白-1的细胞抑制剂(cIAP1/2)形成复合物I，其中RIPK1通过TRAF2/5，cIAP1/2在63位的赖氨酸被多泛素化，活性受到抑制，当体内Caspase-8活性降低或者缺失时，复合体I中的RIPK1去泛素化后被激活[14]，并与RIPK3相互作用导致RIPK3磷酸化，形成RIPK1-RIPK3复合物招募并磷酸化下游的MLKL[12, 15]，活化的MLKL与磷脂酰肌醇磷酸盐(PIP)、心磷脂(CL)和磷脂酰甘油(PG)结合[14]，形成坏死体复合物易位到细胞膜，其中MLKL破坏细胞膜，导致膜透化、细胞肿胀和破裂，促使细胞内容物如危险相关分子模式(DAMPs)的释放[16]。DAMPs的产生是慢性和急性炎症的关键因素，可触发免疫反应并与模式识别受体结合，将原代免疫细胞募集到坏死部位，导致炎症反应发生[14]。

在正常情况下，DAMPs存在于细胞内，坏死性凋亡导致大量DAMPs释放，DAMPs通过半胱天冬酶1依赖性机制产生炎症细胞因子，并形成核苷酸结合寡聚结构域样受体(NLRP3)炎症小体。NLRP3炎症小体可介导IL-1α，IL-1β，IL-33和IL-18的分泌。IL-1β和IL-18激活嗜中性粒细胞，巨噬细胞，Th1和Th17淋巴细胞，导致1型气道炎症[15-16]。IL-33在肺上皮细胞中高表达，释放后驱动以调节性T细胞、嗜酸性粒细胞和细胞因子为特征的2型免疫应答。另外，IL-33与表达ST2的细胞(包括先天性和适应性免疫细胞)结合[15]，可激活NF-κB途径，刺激细胞因子/趋化因子的产生以及嗜酸性粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞的脱颗粒。IL-33还可以促进巨噬细胞向替代激活的促纤维化M2表型分化，导致促纤维化细胞因子(包括单核细胞化学吸引蛋白(MCP-1)、IL-6和转化生长因子(TGF)-β1)的上调，加重呼吸系统疾病中的气道炎症和组织损伤[9]。

此外，有研究发现，TLR3、TLR4以及干扰素调节因子(DAI)的DNA依赖性激活剂也可直接激活RIPK3来促进坏死性凋亡[12, 17]，但其一般机制和慢阻肺的关系尚未明确[18]。

三、坏死性凋亡与慢性阻塞性肺疾病

慢阻肺的特征是持续存在的呼吸系统症状和气流受限[19]，其发病率和死亡率逐年上升，严重影响患者的工作能力和生活质量，造成沉重的社会经济负担[20]。大量研究表明，慢阻肺由长期暴露于香烟烟雾(CS)、室内外空气污染物、过敏原、化学毒素，细菌和病毒感染的异常细胞反应或基因突变等引起，其中CS是最常见的危险因素。目前驱动慢阻肺炎症和随后组织重塑的机制尚不完全清楚，但长期吸烟引起持续的慢性炎症是慢阻肺的典型特征，即使戒烟数年后仍无法恢复[21]。

据统计，80%～90%的慢阻肺患者为吸烟者，10%～15%的吸烟者会发展为慢阻肺患者[3]。CS中含有数千种化学毒物，其中大量是抗原、致癌物、细胞毒物等，是驱动肺部疾病发病机制和进展的主要因素[3, 18]。CS暴露可激活免疫细胞产生过多的溶酶体酶、氧自由基、髓过氧化物酶和弹性蛋白酶，导致细胞内氧化/抗氧化失衡，损害巨噬细胞吞噬细菌的能力，降低自然杀伤细胞的活性，也可诱导气道上皮细胞分泌各种炎症因子、内源性活性氧以及线粒体损伤等[18, 20]，最近的研究表明，CS暴露可诱导肺内组织坏死性凋亡介导的炎症反应。

(一)坏死性凋亡调节香烟烟雾诱导的肺上皮细胞炎症反应

Chen等人发现在CS诱导的肺气肿小鼠模型及慢阻肺患者肺上皮细胞内，磷酸化的MLKL(pMLKL)和高迁移率组框(HMGB1)释放显著增加。为进一步证明CS可引起坏死性凋亡，他们研究了在体外暴露于CS的细胞，观察到细胞中的pMLKL和细胞培养基中的HMGB1释放增加，且随着烟雾暴露时间和剂量的增加而增加。同时，他们发现RIPK1的缺失不会影响CS诱导的细胞死亡，而RIPK3的耗竭抑制了体外CS诱导的坏死性凋亡信号通路，减弱了体内CS引起的气道炎症。由于MLKL是RIPK3的下游效应分子，因此他们进一步研究发现CRISPR/Cas9对MLKL的消耗也保护了小鼠肺上皮细胞免受CS诱导的坏死，由此证明CS诱导的肺上皮细胞坏死性凋亡是由RIPK3/MLKL介导的[22]，随后Lu等人也证实了这些发现，他们发现与从不吸烟或无慢阻肺疾病的吸烟者对照组相比，尤其重度慢阻肺患者上皮细胞和巨噬细胞中的总MLKL蛋白以及肺组织中的pRIPK3和pMLKL增加，且RIPK3和pMLKL的耗竭可缓解CS暴露后的气道炎症和组织重塑[23]。总之，这些结果表明，CS可诱导坏死性凋亡的发生，尤其RIPK3介导的坏死性凋亡引起了慢阻肺的肺部炎症和肺气肿的进展。靶向抑制RIPK3及其下游途径可能是慢阻肺的有效治疗方法。

(二)坏死性凋亡调节香烟烟雾诱导的巨噬细胞炎症反应

巨噬细胞是先天免疫细胞，在防御外源性病原体及炎症反应中起着关键作用。巨噬细胞分为经典激活型(M1)和替代激活型(M2)。M1巨噬细胞由IFN-γ和脂多糖(LPS)诱导[24]，产生诱导性一氧化氮合酶(iNOS)和TNF-α，发挥促炎和细胞毒性作用；M2巨噬细胞受到IL-4、IL-13的刺激后，可表达CD163和CD206，分泌Arg1和TGF-β，参与免疫调节和组织重塑过程[25-26]。肺泡巨噬细胞在气道炎症中起核心作用[16]，其中M1肺泡巨噬细胞通过分泌大量炎症介质、活性氧，金属蛋白酶和组织蛋白酶，促进多种炎症细胞的迁移，破坏肺泡结构并诱导纤维化介质如TGF-β1等触发气道重塑，促进慢阻肺的发展[16, 27]。

Wang等人观察到CS暴露导致小鼠肺泡巨噬细胞和骨髓源性巨噬细胞(BMDM)中RIPK1和RIPK3水平显著增加，他们发现坏死性凋亡会促进巨噬细胞中CS诱导的炎症反应，而抑制RIPK1或RIPK3可缓解CS诱导的BMDM中炎症细胞因子的mRNA转录水平，明显减弱了后续的炎症反应[10]。先前研究已证实，NF-κB是一种调节各种炎症基因表达的转录因子，与慢阻肺的发病机制密切相关[28]，通常由P50/P65异源二聚体组成，其中P65控制NF-κB的转录激活。Wang等人进一步研究发现坏死凋亡可调节p65的磷酸化状态，进而调节巨噬细胞中的炎症基因转录。另外，也有研究报道RIPK3上调可通过NF-κB途径引起炎症反应[10]。这些研究表明CS诱导的肺泡巨噬细胞坏死性凋亡可能通过NF-κB信号传导通路促进肺部炎症。不过，参与调节NF-κB通路的特定坏死凋亡相关机制仍然未知，需要进一步研究。

(三)坏死性凋亡参与调节线粒体功能障碍及线粒体自噬

线粒体是真核细胞的能量工厂，可以为身体的各种生理活动提供能量[20]。研究发现，CS可以诱导肺组织细胞内线粒体活性氧(mtROS)增加，使电子传递链活性降低以及线粒体膜电位丧失[29]、线粒体动力学失调，并触发线粒体DNA(mtDNA)释放[21]，释放的mtDNA对氧化剂应激敏感，被氧化后造成线粒体基因组中突变基因积累，进一步降低了电子传递链活性的效率，增加mtROS的产生，受损的线粒体也是mtROS的主要靶标，导致线粒体蛋白和mtDNA的进一步受损，形成恶性循环[29]。过度的氧化应激导致与DNA损伤反应相关的标记物增加，有助于持续炎症[21]；大量的mtROS也通过多种机制引起肺部炎症，破坏肺上皮细胞的结构和功能，促进慢阻肺的发展[29]。

Giordano等人发现，慢阻肺患者肺中RIPK3的上调以及CS暴露的小鼠肺中的RIPK1和RIPK3水平升高，可促进受控细胞膜裂解，也促进mtDNA释放到细胞外空间，引起一系列炎症反应发生。这说明坏死性凋亡参与调节mtDNA的释放，促进线粒体功能障碍[21]；Mizumura等人发现，CS暴露细胞产生过量酸性鞘磷脂酶(ASM)和丝氨酸棕榈酰神经酰胺(C16-Cer)，诱导线粒体自噬蛋白(PINK1)增加，促进线粒体自噬及细胞的坏死性凋亡，他们还发现，线粒体自噬抑制剂Mdivi-1可减少坏死性凋亡途径中MLKL的磷酸化，并显示出对CS诱导细胞死亡的保护作用[30]。另外，也有研究发现，线粒体自噬蛋白PINK1的遗传耗竭减少了肺上皮细胞坏死性凋亡，改善了肺功能[12]，且抑制线粒体自噬可减轻线粒体功能障碍和细胞损伤[31]。这些结果表明，CS诱导的线粒体自噬可能导致细胞坏死性凋亡。

线粒体自噬是一种靶向自噬形式，有助于清除肺组织中暴露于CS后诱导的受损线粒体[32]。但线粒体自噬在CS诱导的慢阻肺发展中，是否起到保护作用或有害作用仍然存在争议[33]。以上研究发现CS诱导线粒体自噬的激活可能促进坏死性凋亡发生，坏死性凋亡也可促进mtDNA释放加重线粒体损伤，产生大量炎症因子，引起持续的气道炎症。因此，坏死性凋亡可通过参与调节CS诱导的线粒体功能障碍及线粒体自噬，促进慢阻肺中的肺部炎症及肺气肿的进展。

四、结论与展望

综上所述，慢性阻塞性肺疾病是一种慢性气道炎性病变，目前关于慢阻肺的治疗主要包括支气管扩张剂、糖皮质激素、抗生素及祛痰药，但这些治疗措施不能有效缓解或预防肺功能衰减。坏死性凋亡引发的一系列炎症反应参与了肺气肿形成和气道重塑。多项动物及体外研究表明，抑制坏死性凋亡可减轻香烟烟雾诱导的气道炎症、气道重塑及肺气肿的发展，坏死性凋亡通路的靶向抑制剂有望成为慢阻肺的一种潜在治疗策略。因此，未来还需要更多的研究证明坏死性凋亡抑制剂在慢阻肺患者中的作用，这对慢阻肺的防治，寻找新的治疗靶点有着重要的意义。