防御素调控动物肠道稳态的研究进展

■杨乐铠 朱嘉豪 范曜天 习欠云

(华南农业大学动物科学学院，广东广州 510642)

1 防御素生物结构及来源

防御素是一类由低等或高等真核生物产生、12～50个氨基酸组成，具有两亲性且富含半胱氨酸的新型阳离子宿主防御肽[1]。作为抗菌肽家族的重要成员，防御素有3个亚家族：α、β、θ防御素。这3种防御素具有3 个固定配对的二硫键，有着非常相似的折叠构象，这些是多肽亚家族的特征[2-4]。α防御素通常由29～35个氨基酸组成，富含精氨酸、半胱氨酸，且半胱氨酸以CysⅠ-CysⅥ、CysⅡ-CysⅣ、CysⅢ-CysⅤ连接方式形成3 对分子内二硫键[5]。α防御素研究得比较广泛，它通常存在于嗜中性粒细胞和潘氏细胞中[6-7]。β防御素是约40个氨基酸残基组成的多肽，最早是从牛的气管和中性粒细胞中分离出来的，随后发现其在人、鼠、牛、羊、猪的多种器官黏膜表面，包括呼吸道和黏膜下腺上皮细胞广泛表征[8]。与α防御素不同的是，它分子内二硫键是通过CysⅠ-CysⅤ、CysⅡ-CysⅣ、CysⅢ-CysⅥ的连接形成[9]。θ防御素通常是由12个氨基酸组成，大小约2 ku 的阳离子多肽，最早是从恒河猴中性粒细胞和单核细胞所分离出来的，二硫键通过CysⅠ-CysⅥ、CysⅡ-CysⅤ、CysⅢ-CysⅣ连接形成的闭合环状多肽链[10-11]。

表1 哺乳动物体内防御素的分类

2 防御素生物功能

防御素具有广谱的杀菌活性，可以有效的抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性菌活性。早期防御素的抗菌机制被归纳为“Shai-Matsuzaki-Huang（SMH）模型”[12]，该模型认为防御素通过与细菌质膜的相互作用进入双亲性分子层中，带正电荷的一侧与细菌质膜带负电荷磷脂分子头部相结合[13]，细菌磷脂分子随即被防御素移位导致出现一个个缺口，形成环状孔隙，细胞膜结构被破坏而失去作用。随着研究的不断深入，包括“桶板”模型、“毯式”模型、“环形孔”模型和“凝聚”模型在内的多种新的防御素作用假说被提出，但具体的抗菌机制有待进一步的研究证实[14-15]。

防御素除了具有抗菌作用外，部分防御素也具有抗真菌、病毒活性。Stuyfs等[16]实验表明，植物性源防御素在低剂量下对白色念珠菌具有一定的抑制效果。而Bals[17]研究表明，鼠β防御素1 对HIV 病毒、疱疹状病毒等具有明显抑制甚至杀灭效果。防御素的抗病毒机制主要通过与病毒外壳蛋白结合从而导致病毒丧失生物活性，这一特殊作用机理也使得病原微生物不易对其产生抵抗性[18]。

3 防御素调控肠道稳态机制

随着近年来抗生素在动物饲料行业的禁用使得寻找替抗产品迫在眉睫，而防御素可以发挥类似抗生素的生物活性作用，且不会产生耐药性，可以很好的应用于动物饲料产业保护动物肠道健康。它通过增强肠道屏障功能、促进肠黏膜免疫、调控微生物菌群平衡机制来维持动物肠道稳态，有望成为动物饲料产业中后抗生素时代的替抗产品。

3.1 防御素与肠道屏障

肠道屏障是由肠道最外层的上皮细胞构成，肠道屏障的完整性是肠道稳态的基础，它能够避免潜在病原体的入侵，确保共生菌群的动态平衡[19]。有相关研究显示：肠上皮细胞通过模式识别受体（PRR）探测肠道微生物区系，而肠道微生物区系已被证明对健康的肠道屏障至关重要[20-21]。当PRR 被它们各自的配体刺激时，它们会诱导机体产生第一道防线，这包括防御素以及协调信号分子和黏蛋白的产生和释放[22-23]，而紧密连接蛋白和黏蛋白被认为是肠道屏障完整性的关键。最近的研究表明，防御素参与调节黏蛋白和紧密连接蛋白的表达[24]，人β防御素2（HBD-2）刺激人上皮克隆结肠腺癌细胞后，黏蛋白2（MUC-2）的表达增强[25-26]，相反，MUC-2 的上调又促进了HBD-2 的表达，这种HBD-2和MUC-2之间的正向调节关系，在保证肠道屏障的完整性方面发挥重要作用。除此之外，人β防御素3（HBD-3）也被证明可触发多种紧密连接蛋白的合成[19，27]，防御素LL-37 还可以结合趋化因子受体以及Toll 样受体激活多个信号转导途径促使机体黏蛋白5（MUC-5）基因表达增多[28]，MUC-5分泌增加，促进肠道屏障的完整。上述研究表明，防御素可以调控紧密连接蛋白和黏蛋白表达来促进肠道上皮完整，增强肠道屏障功能来调控肠道稳态。

3.2 防御素与肠黏膜免疫

免疫系统可以保护宿主免受病原微生物的侵袭，根据对病原微生物的作用机制可分为先天性免疫和获得性免疫[29]。肠黏膜免疫包括先天性免疫和获得性免疫。先天性免疫作用依赖于某些受体或分泌蛋白，这些受体或分泌蛋白能够识别不同病原微生物之间的共同特征（例如脂多糖）[30]。防御素作为动物先天免疫系统的天然活性物质，具有很强的免疫调节和抗菌作用，提供了抵御外来微生物病原体的第一道防线[31]，且能够激活和调节获得性免疫反应[32-33]。有研究表明：人β防御素(HBD-1）和（HBD-2）对表达趋化因子受体CCR-6的细胞（如树突状细胞）具有趋化活性，能够募集淋巴细胞、吞噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞来杀死病原细菌维持肠道稳态[34]；Lin等[35]研究证实了防御素Ⅲ涉及活化蛋白激酶p38 和转录因子NF-κB的机制诱导T84肠道细胞分泌趋化因子IL-8促进炎症反应的发生，从而启动免疫应答。这表明防御素在先天免疫和获得性免疫反应之间起到桥梁作用[36]。潘氏细胞α防御素对肠黏膜免疫的突出贡献也可以从敲入人α防御素(HD5)的小鼠的表型观测出来。有相关研究显示：当用鼠伤寒沙门氏菌口服接种时，与对照组相比，表达HD5小鼠对感染具有免疫力，且发现小鼠的肠腔和脾脏中可回收鼠伤寒沙门氏菌鲜见[37]。这些实验表明，潘氏细胞分泌的α防御素参与肠黏膜免疫直接或间接杀死入侵的病原体来维持肠道稳态，促进宿主肠道健康。

3.3 防御素与微生物群落

宿主微生物菌群代谢活动和宿主肠道之间动态平衡作用直接影响着动物的正常生理功能和状况[38-39]。有报道表明，肠道微生物菌群的破坏（也称为生态失调）会导致动物肠道代谢功能紊乱，甚至出现各种病理状况，如发生细菌感染和慢性肠道炎症、营养不良甚至肥胖等疾病[40-43]。

防御素作为肠道内源性关键活性物质，参与对肠道微生物的调控，使微生物在宿主处于一种动态平衡过程。例如，在纯合DEFA5+/+小鼠中，肠道微生物有益菌群组成与野生型菌株有所不同，厚壁菌门所占百分比显著下降，而拟杆菌门所占百分比显著上升[44]。这表明防御素通过调控肠道微生物菌群平衡来维持肠道稳态[45]。除此之外，也有研究结果表明，小鼠潘氏细胞中表达HD5 可以通过减少肠腔和粪便中的细菌数量，减少细菌易位，提高致命沙门氏菌攻击后的高存活率，增强了小鼠肠道对沙门氏菌感染的抵抗力[45]。α防御素对细菌具有选择性杀菌活性，对病原菌有很强的杀菌活性，但对共生菌的杀菌活性很低，甚至没有杀菌活性[46]，这种选择性杀菌活性取决于二硫键的有无。小鼠潘氏细胞α防御素中，隐窝素4 是最有效的杀菌剂。有相关研究表明，含3个二硫键的小鼠隐窝素4对病原菌具有很强的杀菌活性，但对双歧杆菌、干酪乳杆菌和脆弱类杆菌等共生类杆菌几乎没有杀菌活性。相比之下，还原后的隐窝素没有二硫键，既能杀死致病细菌，又能杀死共生细菌。这表明潘氏细胞α防御素具有二硫键依赖的杀菌活性。以上研究表明，α防御素不仅能够杀死病原细菌，还参与并调控肠道微生物的组成来维持肠道稳态。

4 结语

近年来随着抗生素在动物饲料产业中的全面禁用，替抗成为当今人类研究的热门话题。防御素具有相对分子质量较小、结构稳定、广谱抗菌活性、易消化等特点，在肠道屏障功能、肠黏膜免疫反应以及微生物菌群平衡方面发挥着积极作用，有望成为动物饲料产业中的替抗产品。尽管人们对于防御素的研究取得了新的进展，但防御素在动物饲料替抗中的应用还处于探索阶段，比如防御素的抑菌机理研究的不够透彻、价格昂贵、剂量使用不明确等。未来研究将更加着重关注防御素在动物环保型饲料添加剂中的应用。随着生物技术的发展，相信防御素在动物饲料替抗产品中会取得新的突破，有望解决长期使用抗生素而出现的耐药性、药物残留以及环境污染等问题，为防御素在动物饲料替抗中的应用提供新的参考。