人干扰素α1b体外抗SARS-CoV-2 Omicron株的药效

刘琳琳，李玉薇，邹勇，张雪梅，卢佳，刘小可，王泽鋆，刘玉林，刘景会

1.长春生物制品研究所有限责任公司，吉林 长春 130012；2.武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北 武汉 430000

干扰素（interferon，IFN）作为广谱抗病毒药物，是目前用于临床治疗最重要的细胞因子之一。IFN在宿主细胞受到刺激（如病毒、细菌等各种病原体感染）时产生，并最终启动机体免疫系统的防御机制［1］。IFN 作用于同一或邻近细胞的IFN 受体，激活一系列抗病毒级联反应，从而诱导上百种含IFN 刺激反应元件的基因转录［2］。这些IFN 激活大量抗病毒相关基因的表达，如2′，5′-寡腺苷酸合成酶、蛋白激酶、抗黏液病毒蛋白等［3］。严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）Omicron 株在感染早期可能传染性较高，但当其试图扩散至上呼吸道以外或遇IFN 抑制时，病毒数量及感染能力会迅速下降。IFN作为天然免疫的关键细胞因子，是防御病毒入侵的第一道防线。研究表明，使用IFN 后，虽然其自身在人体内代谢较快，但其激发的抗病毒蛋白可在人体内稳定存在多日［4］。感染前或感染早期，IFN 会有效刺激上皮细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制或清除Omicron株病毒，但如果细胞已被病毒破坏，IFN 则无法修复被感染细胞。因此，感染初期，IFNα 对SARS-CoV-2 的抑制是有效的。

免疫力低下人群不能及时产生足量内源性IFNα，使病毒获得复制机会，这是部分人群易感并逐步趋向重症化的原因。因此，提前补充外源IFNα 可快速提高人体免疫力，达到预防病毒及抗病毒的目的。IFN 具有广谱抗病毒效果，对呼吸道合胞病毒、疱疹病毒、流感病毒、副流感病毒、冠状病毒等呼吸道病毒均具有抑制作用［5］。国家卫生健康委员会连续印发的第一至第八版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》，均推荐成人每日2 次雾化吸入500 万IU 或相当剂量IFNα［6］。眼部、鼻腔、咽部、呼吸道黏膜系统缺少角质层保护，且有病毒受体，是病毒感染初期主要途径。而呼吸道黏膜系统有IFNα受体，通过使用人IFNα1b滴眼（眼部黏膜、鼻泪管）、滴鼻、喷鼻（鼻腔和咽部）也可使上呼吸道黏膜系统在IFN 作用下产生大量抗病毒蛋白，使机体处于抗病毒状态，有效阻止病毒吸附、脱壳、核酸复制、组装、释放等，从而抑制病毒感染、增殖，起到应急预防和早期治疗的作用。

本研究在体外细胞水平上，采用qPCR 法检测人IFNα1b 对 SARS-CoV-2 Omicron 株（BA.5／BA.2／BA.1）的抑制效果，探索低活性／浓度人IFNα1b 的抗病毒作用，对评价人IFNα1b 在应急预防和治疗SARS-CoV-2感染上的有效性具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病毒及细胞 SARS-CoV-2 Omicron 株（BA.5／BA.2／BA.1）由武汉生物制品研究所有限责任公司提供，常规传代，-80 ℃保存，Vero 细胞也由该公司提供。

1.2 IFN及阳性对照药 人IFNα1b原液（批号：SCF1-B202201，蛋白含量：3.8 mg／mL，生物学活性：5.1 ×107IU／mL）、人IFNα1b滴眼液（批号：20220502，生物学活性：1.0×105IU／mL，比活性1.5×107IU／mg，分子量：19 382 kD）、人IFNα1b 喷雾剂（批号：2022-1106，生物学活性：5.0 × 105IU／mL）均由长春生物制品研究所有限责任公司提供；瑞德西韦（Remde-sivir）购自美国吉利德科技公司。

1.3 主要试剂及仪器 DMEM 培养基、胰蛋白酶、无菌PBS 缓冲液（pH 7.2 ～7.4）购自迈晨科技（北京）有限公司；CCK-8 试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；DMSO 购自生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸提取或纯化试剂（批号：2021108）、新型冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒（批号：2021208）、全自动核酸提取仪（Stream SP96）购自广州达安基因股份有限公司；细胞培养瓶、96 孔培养板购自美国Corning公司；实时荧光定量PCR仪（QuantStudio5）购自美国ABI公司。

1.4 细胞毒性检测 采用CCK-8法检测人IFNα1b原液、人IFNα1b滴眼液、人IFNα1b喷雾剂、瑞德西韦共4种药物的细胞毒性。将Vero细胞按2×104个／mL接种 96 孔板，0.1 mL／孔，37 ℃，5% CO2孵箱培养18 ～24 h 至细胞长成单层；弃培养基，加入不同浓度工作液［人IFNα1b 原液：稀释至1 × 107IU／mL 后，进行 3 倍系列稀释，共 8 个稀释度；人 IFNα1b 滴眼液：稀释至1 × 105IU／mL 后，进行3 倍系列稀释，共8 个稀释度；人IFNα1b喷雾剂：稀释至1×105IU／mL后，进行3 倍系列稀释，共8 个稀释度；阳性对照药：瑞德西韦稀释至 150 μmol／L 后，进行 3 倍系列稀释，共8 个稀释度］，100 μL／孔，每个稀释度重复6孔，37 ℃，5% CO2孵箱培养 72 h；加入 CCK-8 试剂，20 μL／孔，继续培养1 ～ 4 h；检测各孔450 nm 波长处的A值，按下式计算受试物对细胞存活率的影响，将数据输入GraphPad Prism 计算半数毒性浓度（CC50）。

细胞存活率（%）=［（A实验孔-A空白孔）／（A对照孔-A空白孔）］×100%

1.5 抗SARS-CoV-2 Omicron株活性检测

采用qPCR法［7-15］。将Vero细胞按2 × 104个／mL接种96 孔板，37 ℃，5% CO2孵箱培养至细胞长成单层，备用。

1.5.1 人IFNα1b预孵育2 h后攻毒 将人IFNα1b原液稀释至5×103IU／mL，进行3 倍系列稀释，共8 个稀释度，每个稀释度设4个复孔，作为IFN 抑制组；将50 μmol／L瑞德西韦进行3倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度设2 个复孔，作为瑞德西韦抑制组。将各组药品接种96孔板，100 μL／孔，37 ℃，5%CO2孵箱继续培养2 h；弃培养基，PBS洗板2次，100 μL／孔，同时设细胞对照组（正常细胞培养）和病毒对照组（仅在细胞中加入病毒）；将Omicron株（BA.5／BA.2／BA.1）按MOI=0.01 加入相应细胞孔，100 μL／孔，37 ℃，5%CO2孵箱培养2 h；弃病毒液，PBS洗板2次，100 μL／孔，加入细胞维持液，200 μL／孔，37 ℃，5%CO2孵箱继续培养24 ～72 h。显微镜下观察细胞病变形态，病毒对照组细胞病变程度超过75%以上时进行qPCR检测。

1.5.2 人IFNα1b 与病毒同孵育 IFNα1b 原液和瑞德西韦稀释以及Omicron 株（BA.5／BA.2／BA.1）攻毒剂量同1.5.1 项。将药品与病毒同时加入Vero细胞，37 ℃，5% CO2孵箱培养2 h；弃混合液，PBS 洗板2 次，100 μL／孔，加入细胞维持液，200 μL／孔，37 ℃，5%CO2孵箱继续培养。显微镜下观察细胞病变形态，在病毒对照组病变程度超过75%以上时进行qPCR检测。

1.6 qPCR 法 培养结束后，每孔取上清液0.2 mL，依次加入0.5 mL 裂解液和0.02 mL 蛋白酶K，混匀，70 ℃加热15 min，收集样品，全自动核酸提取仪提取核酸，采用新型冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒，于实时荧光定量PCR仪上检测SARS-CoV-2 RNA水平。按下式计算不同稀释倍数下供试品对SARSCoV-2 的抑制率，将数据输入GraphPad Prism 计算半数有效浓度（EC50）。

抑制率（%）=［1-（药品组病毒核酸拷贝数／病毒对照组病毒核酸拷贝数）］×100%

2 结果

2.1 细胞毒性 结果显示，人IFNα1b原液CC50无法计算，所有试验孔状态良好，表明最高浓度（1×107IU／mL）人IFNα1b 原液对Vero 细胞未达到半数细胞毒性；瑞德西韦CC50无法计算，所有试验孔状态良好，表明最高浓度（150 μmol／L）瑞德西韦对 Vero 细胞未达到半数细胞毒性；人IFNα1b滴眼液的CC50为29 958 IU／mL，人 IFNα1b 喷雾剂的 CC50为 37 550 IU／mL，表明高浓度人IFNα1b 滴眼液和人IFNα1b 喷雾剂对Vero 细胞具有毒性。见图1。

图1 人IFNα1b原液（A）、人IFNα1b滴眼液（B）、人IFNα1b喷雾剂（C）、瑞德西韦（D）对Vero细胞毒性的检测Fig.1 Determination of cytotoxicity of human IFNα1b bulk（A），human IFNα1b eye drops（B），human IFNα1b spray（C）and Redesivir（D）on Vero cells

2.2 人IFNα1b抗SARS-CoV-2 Omicron株活性

2.2.1 人 IFNα1b 预孵育 2 h 后攻毒 人 IFNα1b 对BA.1 株的 EC50为 9.30 IU／mL（32 pmol／L），瑞德西韦为 0.314 7 μmol／L；人 IFNα1b 对 BA.2 株的EC50为 13.38 IU／mL（46 pmol／L），瑞德西韦为0.291 0 μmol／L；人 IFNα1b 对 BA.5 株的 EC50为12.33IU／mL（42.4pmol／L），瑞德西韦为0.3003μmol／L。见图2。

图2 预防组人IFNα1b（A）和瑞德西韦（B）对SARS-CoV-2 Omicron株（BA.5／BA.2／BA.1）的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of human IFNα1b（A）and Remdesivir（B）against SARS-CoV-2 Omicron strain（BA.5／BA.2／BA.1）in prevention group

2.2.2 人IFNα1b 与病毒同孵育 人IFNα1b 对BA.1株的EC50为19.68 IU／mL（67.7 pmol／L），瑞德西韦为 0.320 5 μmol／L；人 IFNα1b 对 BA.2 株的 EC50为10.91IU／mL（37.5pmol／L），瑞德西韦为0.2744μmol／L；人IFNα1b对BA.5株的EC50为18.84 IU／mL（64.8pmol／L），瑞德西韦为0.304 1 μmol／L。见图3。

图3 同时攻毒组人IFNα1b（A）和瑞德西韦（B）对SARSCoV-2 Omicron株（BA.5／BA.2／BA.1）的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of human IFNα1b（A）and Remdesivir（B）against SARS-CoV-2 Omicron strain（BA.5／BA.2／BA.1）in simultaneous challenge group

3 讨论

目前由SARS-CoV-2 感染引起的新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）疫情仍在全球暴发流行［16-19］。2022年底，我国出现各种SARSCoV-2 Omicron 株大规模感染，具有传播速度快、毒力强和容易免疫逃逸等特点［20-22］。SARS-CoV-2病原学复杂，易发生变异，给疫苗研究和有效接种带来了巨大困难，目前仍缺乏针对性特效药物［23-25］。

本研究结果显示，在体外细胞水平上，极低活性／浓度的人IFNα1b对SARS-CoV-2 Omicron株（BA.5／BA.2／BA.1）均具有较好的抑制活性，且人IFNα1b原液的细胞毒性极低，治疗指数高，优于阳性对照药物。关于人IFNα1b在体内是否具有相同的抑制效果，尚需进一步确认，因此后续将开展人IFNα1b 体内抗SARS-CoV-2 Omicron 株感染的药效评价。

研究表明，SARS-CoV-2 在鼻腔的内皮细胞滴度相对较高，咽喉和支气管逐渐降低，肺部相对较低，这种病毒的感染模式和分布提示，IFN通过滴鼻或喷雾递送至鼻腔或喉咙，可能在局部有效抑制SARSCoV-2 的感染［26］，起到类似疫苗的预防作用。因此，人IFNα1b 滴眼液和人IFNα1b 喷雾剂有希望成为临床预防SARS-CoV-2 Omicron株感染的特效药。