沉默E6相关蛋白对人乳头瘤病毒阴性宫颈癌细胞中p53蛋白表达水平的影响

解亦航，郭宇微，孙渤轩，辛杨，于嘉敏，赵春艳

大连医科大学检验医学院临床生化检验教研室，辽宁 大连 116044

抑癌基因p53具有调控细胞周期、细胞凋亡和维持基因组稳定性等多种重要功能，在保持遗传完整性及避免生物细胞癌变等方面具有重要作用［1-3］。50%以上肿瘤细胞中存在p53的缺失、突变或功能失活［4-5］。正常细胞在缺氧、射线、癌基因激活等压力下会激活p53途径，启动细胞凋亡或基因修复，而癌细胞（即使存在野生型p53）几乎均缺乏激活p53途径的能力［6］。因此，尽管癌细胞暴露于各种形式的致癌应激环境中（如致癌基因激活、细胞缺氧和正常环境丧失），仍可继续增殖和存活［7］。有研究表明，p53蛋白使细胞在压力条件下通过凋亡避免细胞癌变［1，7］，激活宫颈癌细胞中休眠的p53可抑制肿瘤细胞生长［8-9］。因此，抑制野生型p53降解、恢复突变体p53结构、促进p53重新激活是癌症治疗药物重要的研发方向。活化的（割裂的）半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（cleavedcysteinyl aspartate specific proteinase-3，cleaved-caspase-3）是诱导细胞凋亡的关键效应分子，其蛋白水平可反映细胞的凋亡情况［10-11］。在正常细胞中，主要通过鼠双微体2（murine double minute 2，Mdm2）介导的泛素化降解途径进行p53蛋白的调控［12-13］。

高危人乳头瘤病毒（high risk human papilloma virus，HR-HPV）入侵机体细胞后，病毒自身编码的E6蛋白通过与E6相关蛋白（E6-associated protein，E6AP）结合介导p53泛素化降解，从而逃避由p53触发的细胞凋亡［14-15］。但在非HPV 感染的宫颈癌细胞（C33A）中，E6AP对p53蛋白的调控作用尚未明确［16］。因此，本研究通过siRNA 技术沉默E6AP 表达，探讨沉默E6AP 对C33A 细胞中p53 蛋白水平的影响，以期为后续宫颈癌治疗药物的研发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 C33A细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清（11011-8611）购自浙江天杭生物科技股份有限公司；青-链霉素（SV30010）和MEM 培养基（SH30024.01）均购自美国HyClone公司；LipofectamineTM2000 转染试剂盒（11668-019）购自美国Invitrogen公司；RIPA（弱）裂解液（P0013D）及ECL 均购自上海碧云天生物技术有限公司；鼠抗p53 单克隆抗体（60283-2-lg）及兔抗E6AP 多克隆抗体（10344-1-AP）均购自美国Proteintech 公司；兔抗cleaved-caspase-3 多克隆抗体（WL02117）购自沈阳万类生物技术有限公司；兔抗GAPDH 多克隆抗体（AP0063）购自南京巴傲得（Bioworld）生物科技有限公司；HRP标记的山羊抗兔IgG（ZB-2301）及山羊抗鼠IgG（ZB-2305）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；PVDF膜（IPFL00010）购自德国Merck Millipore公司。

1.3 E6AP的siRNA 沉默 参考文献［8-9］方法，设计特异性沉默E6AP的siRNA序列（siE6AP：5′-CAACUCCUGCUCUGAGAUATT-3′）及沉默对照无序siRNA序列（siControl：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′），序列均由苏州吉玛基因股份有限公司合成。

1.4 细胞培养 将C33A 细胞用含10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗的MEM 培养基，于37 ℃，5% CO2条件下常规培养。

1.5 细胞转染 取对数生长期的C33A 细胞，接种至24 孔板，1.5 × 105个／孔，于37 ℃，5% CO2条件下培养18 h；在LipofectamineTM2000 转染试剂的介导下将 siE6AP 及 siControl 序列分别转染 C33A 细胞，继续培养6 h；更换含10%胎牛血清的MEM 培养基（不含抗生素）。转染48 h 后，用4 ℃预冷的PBS 洗涤1次，RIPA（弱）裂解液冰上裂解细胞20 min；于 4 ℃，2 000×g离心10 min，取上清，BCA法蛋白定量。

1.6 沉默E6AP对C33A细胞中E6AP、p53和cleavedcaspase-3蛋白表达水平影响的检测 采用Western blot法。取siE6AP及siControl组C33A 细胞培养上清，经10%及15%SDS-PAGE（前者用于检测E6AP、p53 和GAPDH，后者用于检测cleaved-caspase-3）分离蛋白后，转移至PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h；加入兔抗E6AP多克隆抗体（1∶5 000稀释）、鼠抗p53 单克隆抗体（1∶5 000稀释）、兔抗caspase-3／cleaved-caspase-3 多克隆抗体（1∶500 稀释）及兔抗GAPDH 多克隆抗体（1∶20 000稀释），4 ℃孵育过夜；TBST洗涤3次，每次10 min，加入HRP 标记的山羊抗兔IgG 及山羊抗鼠IgG（均1∶5 000 稀释），室温作用1 h；TBST 洗涤3次，每次10 min，ECL法显色。

1.7 统计学分析 应用SPSS 16.0 统计学软件进行统计学分析，实验数据均采用均值 ± 标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA 沉默 E6AP 的效果 siControl 和 siE6AP组C33A 细胞中E6AP 蛋白表达量分别为（0.506 4 ±0.185 99）和1，前者明显低于后者，且差异有统计学意义（t=-4.597，P＜ 0.05），见图1。表明siE6AP 可沉默C33A细胞中E6AP的表达。

图1 Western blot 法检测siE6AP对C33A细胞中E6AP的沉默作用Fig.1 Western blotting of silencing effect of siE6AP on E6AP in C33A cells

2.2 沉默E6AP对C33A 细胞中p53蛋白表达水平的影响 siE6AP 和 siControl 组 C33A 细胞中 p53 蛋白表达水平分别为（1.572 5±0.218 77）和1，前者明显高于后者，且差异有统计学意义（t=4.533，P＜ 0.05），见图2。表明在C33A 细胞中沉默E6AP 可显著提高p53蛋白水平。

图2 Western blot 法检测沉默E6AP 对C33A 细胞中p53蛋白表达的影响Fig.2 Western blotting of effect of silencing E6AP on expression of p53 protein in C33A cells

2.3 沉默E6AP 对C33A 细胞中凋亡关键效应分子cleaved-caspase-3表达水平的影响 siE6AP和siControl组C33A 细胞中cleaved-caspase-3 的蛋白水平分别为（1.817 8±0.199 55）和1，前者明显高于后者，且差异有统计学意义（t=7.099，P＜ 0.05），见图3。表明在C33A 细胞中沉默E6AP 可显著提高cleaved-caspase-3蛋白的表达水平。

图3 Western blot法检测沉默E6AP对C33A细胞中cleavedcaspase-3蛋白表达水平的影响Fig.3 Western blotting of effect of silencing E6AP on expression of cleaved-caspase-3 protein in C33A cells

3 讨论

泛素化蛋白酶体途径是细胞内蛋白质降解的主要途径之一，该途径主要由泛素活化酶E1、泛素结合酶E2 及泛素蛋白连接酶E3 完成，其中E3 决定了靶蛋白的特异性［16］。目前已知的 E3 酶多达 600 多种，Mdm2 和 E6AP 是两种重要的 E3 酶［16］。Mdm2 是生理情况下介导p53 降解的主要E3 酶，Mdm2 通过与p53 蛋白结合抑制其转录功能，并通过泛素化蛋白酶体途径介导其降解［17］。同时，p53 又可正调节Mdm2表达，从而形成自动反馈调节回路［18-19］。E6AP蛋白广泛存在于几乎所有细胞中，参与多种抑癌基因蛋白的泛素化降解，如早幼粒细胞白血病蛋白（promyelocytic leukemia protein，PML）及簇集蛋白（stress-induced chaperone clusterin，CLU）、p27Kip1等，与宫颈癌、白血病、非小细胞性肺癌、前列腺癌及乳腺癌等多种癌症的发生发展密切相关［16，20-21］。HR-HPV感染的宫颈癌细胞中，在E6 蛋白参与下，E6AP 可介导p53 泛素化降解，使p53 降解由自动反馈调节Mdm2 途径转换为 E6 调控的 E6AP 途径［14-15］，导致p53调控失控。有研究发现，在缺乏E6的情况下，E6AP可单独通过泛素化途径降解p53［15］。目前，对E6AP诱导p53 降解的研究多集中于HPV 感染的宫颈癌细胞或含有野生型p53的HPV 阴性宫颈癌细胞中（如RKO 和 MCF7）［15，22］，对突变型p53在 HPV 阴性宫颈癌细胞研究较少。p53突变是HPV 阴性宫颈癌细胞中p53失活的主要原因［23］，因此，本研究选择HPV阴性的宫颈癌细胞系C33A（其含有Arg273Cys 突变型p53）进行研究。结果表明，沉默E6AP C33A 细胞中的p53 表达水平显著提高（P＜ 0.05），表明E6AP 介导的突变型p53泛素化降解可能存在不依赖E6的途径或其他间接途径，具体机制需进一步深入研究。

caspase-3为caspase 家族成员之一，是参与凋亡途径的关键效应分子。正常状况下，胞质中的caspase-3以无活性Pro-caspase-3形式存在。p53可促使凋亡蛋白释放至细胞质中，诱导凋亡小体进行组装，切割Pro-caspase-3，形成具有活性的cleaved-caspase-3，快速启动细胞凋亡程序［24］。本研究结果表明，沉默E6AP 提高p53 表达水平的同时，可显著提高细胞中凋亡的关键效应分子cleaved-caspase-3 的含量（P＜0.05）。提示在C33A细胞中，可通过沉默E6AP恢复p53活性，进一步诱导细胞凋亡。

恢复p53 活性是抗肿瘤治疗的重要策略之一。在HPV 阳性宫颈癌细胞中，p53 失活主要是由E6AP介导的泛素蛋白酶体途径降解所致；而在HPV 阴性宫颈癌细胞中，p53失活多是由p53的突变所引起［23］。因此，对于野生型p53，可通过抑制蛋白酶体活性以降低p53 的泛素化降解，从而恢复p53 活性；对于突变体p53，治疗策略可分为3类：恢复突变p53的野生型构象和转录活性、靶向突变p53的降解、诱导合成杀伤力［25-26］。目前，针对恢复p53活性的药物研发多集中于破坏 p53-Mdm2 相互作用方面［1］，而 C33A 细胞中p53的突变为热点突变Arg273Cys，该突变使其失去与DNA 结合的能力，从而丧失其抑癌基因活性并获得致癌活性［25-26］。本研究发现，在HPV 阴性宫颈癌细胞中，突变型p53有可能通过E6AP 途径降解，这为靶向调控突变p53的降解提供了实验依据，为癌症治疗药物的设计和研发提供了新靶点。