人鸟苷酸结合蛋白5基因启动子核心调控区域的鉴定及其转录活性分析

叶婷，杨康，王田甜，廖玉娇，杜文倩，黄敏，蒋佩文，李敏惠，杨平

1.成都医学院基础医学院，四川 成都 610500；2.成都医学院科研实验中心，四川 成都 610500；3.成都医学院生物科学与技术学院，四川 成都 610500；4.成都医学院药学院，四川 成都 610500；5.成都医学院教务处，四川 成都 610500

鸟苷酸结合蛋白（guanylate binding protein，GBP）是干扰素刺激基因（interferon stimulate gene，ISG）之一［1］。人 GBP 家族有 7 个成员：GBP1 ～ 7，具有多种生物学功能［2］。研究显示，GBP5 在病原菌引起的炎症反应中起重要作用［3］。感染后，机体可通过调控GBP5的表达，激活Caspase-1／11依赖的细胞炎性反应，启动抗感染固有免疫应答［4-6］。同时，GBP5 还具有广谱的抗病毒能力。甲型流感病毒感染宿主细胞后，机体可通过激活转录因子NF-κB调控GBP5启动子活性，诱导GBP5表达进而发挥其抗病毒生物学效应［7］。基因的表达是一个涵盖mRNA 转录、转录后修饰、蛋白质翻译等的复杂过程，而转录因子的调控机制是其中重要环节。目前关于GBP5启动子核心区域的定位和相关转录因子的调控机制尚不清晰。基于此，本研究通过构建人GBP5启动子荧光素酶报告基因质粒，确定GBP5启动子核心区域，筛选出可能调控其启动子活性的转录因子，为进一步探究GBP5的生物学功能奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞及质粒 人胚胎肾上皮细胞293FT 购自美国 Invitrogen 公司；质粒 pGL3-Basic、pGL3-Control 及海肾荧光素酶质粒pRL-CMV 购自美国Promega 公司；pIRES2-EGFP质粒购自南京擎科生物公司。

1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清、Opti-MEM 培养基、DMEM 基础培养基购自美国Gibco 公司；细胞基因组DNA 提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、无内毒素小剂量质粒DNA 提取试剂盒、细胞总RNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；LipoD293 转染试剂购自美国SignaGen 公司；E.coliDH5α、氨苄青霉素购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR 反转录及扩增试剂盒、DL15000 和DL2000 DNA marker、限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ和XhoⅠ以及T4 DNA Ligase 购自日本TaKaRa公司；双荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；蛋白提取裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA 蛋白定量试剂盒购自中国Transgene公司；兔抗人GBP5、GAPDH单克隆抗体以及HRP 标记的山羊抗兔IgG 购自美国CST 公司；PVDF 膜、ECL 显色液购自美国 Millipore 公司；Universal ProbeLibrary Set（Human Probes#1-#90）（Cat.No.04683633001）购自美国Roche 公司；全波长酶标仪（VICTOR-X）购自美国PerkinEImer 公司；实时定量PCR仪（CFX96）购自美国Bio-Rad公司。

1.3 生物信息学分析 通过NCBI数据库查询获得人GBP5（ID：115362）基因组全长序列，选取GBP5基因5′UTR区域上游2 042 bp（-1 995 ～ +47 bp）启动子序列，利用在线网站JASPAR（http：／／jaspar.genereg.net／）对GBP5启动子区域转录因子结合位点进行预测分析。

1.4 目的基因序列的扩增 使用Primer 5 软件设计引物，引物序列见表1，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。以提取的293FT细胞基因组DNA为模板，PCR 扩增获得不同长度的GBP5启动子片段和YY1基因序列，用凝胶回收试剂盒纯化扩增产物。

表1 GBP5不同启动子片段PCR引物信息Tab.1 Primer sequences of different promoter fragments of GBP5 for PCR

1.5 人GBP5启动子序列重组质粒的构建 利用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ对pGL3-basic 质粒和目的序列进行双酶切，用T4 连接酶将目的序列与质粒DNA 按摩尔比5∶1 16 ℃连接过夜，连接产物转化E.coliDH5α，涂布含 100 μg／mL 氨苄青霉素的LB 琼脂平板，37 ℃恒温培养箱倒置培养16 h；挑取单个阳性克隆进行菌落PCR 鉴定。将鉴定正确的质粒转至含100 μg／mL 氨苄青霉素的液体培养基中，37 ℃摇菌12 h；用无内毒素质粒DNA 提取试剂盒提取质粒，并送至南京擎科生物科技有限公司测序。

1.6YY1过表达质粒的构建 用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切目的基因和pIRES2-EGFP 质粒，用T4 DNA 连接酶连接构建YY1过表达质粒pIRES2-EGFP-YY1，方法同1.5项，经菌落PCR及双酶切鉴定后，提取质粒备用。

1.7 细胞转染 采用LipoD293 试剂，具体方法参考试剂说明书进行。提前18 ～24 h 将对数生长期的293FT 细胞接种至96孔板中，2×104个／孔，转染前30 ～60 min 更换新鲜的完全培养基。每组设3 个重复孔，按10∶1 的比例共转染各重组质粒和内参质粒pRL-CMV，同时设阳性对照和阴性对照组，分别以相同的转染比例共转染包含SV40 启动子和增强子序列的阳性对照质粒pGL3-Control 和缺少真核启动子和增强子序列的阴性对照质粒pGL3-Basic。

提前18 ～24 h 将对数生长期的293FT 细胞接种至12孔板中，3×105个／孔，转染前30 ～60 min更换为新鲜的完全培养基，用LipoD293 试剂将YY1过表达质粒转染至293FT 细胞，设转染pIRES2-EGFP 空载体质粒的对照组，48 h 后观察荧光表达情况。RT-qPCR 法检测过表达质粒转染后细胞中YY1mRNA转录水平。使用Roche 在线网站（roche.com）设计引物，引物序列见表2，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。采用Taqman探针法，进行qPCR。反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，共40 个循环。以GAPDH的表达水平为标准进行相对定量，采用2-ΔΔCq法分析YY1基因的表达倍数变化。

表2 RT-qPCR引物序列及探针号Tab.2 Primer sequences and probe numbers of RT-qPCR

1.8 双荧光素酶活性检测 将重组质粒和对照质粒（pGL3-Basic、pGL3-Control）分别与内参质粒 pRLCMV 共转染至293FT 细胞72 h 后，检测荧光素酶活性。用全波长酶标仪检测萤火虫萤光素酶（A560）和海肾萤光素酶（A465）活性，分析启动子不同截短片段的转录活性。

1.9 GBP5蛋白表达的检测 采用Western blot法。用LipoD293 试剂进行YY1过表达质粒转染，提前将对数生长期的293FT细胞接种至6孔板中，6×105个／孔，转染前30 ～60 min 更换为新鲜的完全培养基，转染48 h 后，提取细胞总蛋白，BCA 法定量蛋白质浓度。取等量（50 μg）蛋白，经12%SDS-PAGE分离后，转印至0.45 μm PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h；加入兔抗人GBP5、GAPDH 单克隆抗体（均1∶1 000 稀释），4 ℃孵育过夜；TBST 洗涤3 次，加入HRP 标记的山羊抗兔IgG（1∶1 000 稀释），室温孵育2 h；ECL 试剂盒显色，化学发光仪曝光成像。使用Image Lab 软件进行图像分析，以GAPDH为内参。

1.10 统计学分析 所有试验均独立重复3 次，计量资料以均数 ± 标准差（）表示，使用 GraphPad Prism 7 软件进行统计学分析，多组与对照组的比较采用Dunnett检验和One-way ANOVA检验，两组间比较采用非配对t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1GBP5启动子区域转录因子结合位点预测分析通过 NCBI 数据库查询获得人GBP5（ID：115362）基因组全长序列，选取GBP5基因5′UTR 区域上游2 042 bp（-1 995 ～ +47 bp）启动子序列；JASPAR 在线软件预测结果显示，GBP5启动子区域有多个转录因子结合位点，其中YY1、STAT1和FOXP3的预测评分排序靠前（系统评分值均大于5），见表3。

表3 JASPAR软件转录因子预测结果Tab.3 Prediction result of transcription factor by JASPAR

2.2GBP5启动子各截短片段重组质粒的鉴定GBP5启动子不同截短片段PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，分别可见2 042、1 671、1 180、567和166 bp的特异性条带，大小与预期相符，见图1。双酶切重组质粒质粒 pGL3-GBP5-11、pGL3-GBP5-21、pGL3-GBP5-31、pGL3-GBP5-41、pGL3-GBP5-51后，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，各亚克隆片段大小正确，见图2。鉴定正确的质粒测序结果经BLAST 比对，插入片段与设计序列同源性达100%。以上结果表明重组质粒构建正确。

图1 GBP5启动子截短片段PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of GBP5 promoter truncated fragments

图2 GBP5 启动子各片段重组质粒的双酶切（HindⅢ／XhoⅠ）鉴定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmids of GBP5 promoter fragments（HindⅢ／XhoⅠ）

2.3GBP5启动子活性双荧光素酶活性 结果显示，GBP5启动子各质粒的荧光素酶活性均高于阴性对照组，均具有启动子活性。相比阴性对照组，质粒pGL3-GBP5-21启动子活性最高，而pGL3-GBP5-41显著降低，差异均有统计学意义（t分别为67.59和27.84，P均＜0.05），见图3。表明GBP5基因核心启动子区域为 5′UTR 上游-1 623 ～ -520 bp，当截短GBP5启动子-1 061 ～ -520 bp 区域（转录因子YY1 结合位点）后，启动子活性明显降低，提示在该区域的YY1结合位点可能会显著影响GBP5启动子的活性。

图3 GBP5启动子双荧光素酶活性检测Fig.3 Double luciferase activity assay of GBP5 promoter

2.4 转录因子YY1对GBP5启动子活性的影响

2.4.1YY1过表达质粒的鉴定 PCR 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1 245 bp 的特异性条带，大小与预期相符，见图4。质粒pIRES2-EGFPYY1的双酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1 245 bp 的目的基因片段和5 260 bp 的载体片段，大小均与预期相符，见图5。

图4 YY1的CDS序列PCR产物电泳图Fig.4 Electrophoretic profile of PCR product of YY1 CDS sequence

图5 质粒pIRES2-EGFP-YY1的双酶切（HindⅢ／XhoⅠ）鉴定Fig.5 Restriction map of plasmid pIRES2-EGFP-YY1（HindⅢ／XhoⅠ）

2.4.2YY1过表达质粒的鉴定 RT-qPCR 结果显示，与对照组相比，质粒pIRES2-EGFP-YY1转染组细胞YY1基因mRNA转录水平升高约20 000倍，差异有统计学意义（t=69.39，df=2，P＜ 0.001），表明质粒成功转染293FT 细胞并过表达目的基因。倒置荧光显微镜下观察可见明显荧光表达，见图6。表明YY1瞬时过表达质粒构建成功。

图6 质粒pIRES2-EGFP-YY1 与pIRES2-EGFP 分别转染293FT细胞48 h的荧光显微镜观察（标尺：100 μm）Fig.6 Fluorescence microscopy of plasmids pIRES2-EGFPYY1 and pIRES2-EGFP 48 h after transfection to 293FT cells respectively（Scale bar：100 μm）

2.4.3YY1过表达质粒对GBP5启动子活性及其蛋白表达的影响 双荧光素酶活性分析结果显示，与pGL3-GBP5-21组比较，过表达YY1可显著激活GBP5启动子活性，差异有统计学意义（t= 19.95，df= 2，P＜ 0.001），见图7。Western blot 分析显示，过表达YY1可上调GBP5 蛋白表达水平，见图8。表明YY1是调控GBP5表达的潜在转录因子。

图7 双荧光素酶活性分析过表达YY1对GBP5启动子活性的影响Fig.7 Effect of YY1 overexpression on GBP5 promoter activity analyzed by double luciferase activity

图8 Western blot 分析质粒pIRES2-EGFP-YY1 转染293FT细胞48 h GBP5蛋白表达水平Fig.8 Western blotting of GBP5 protein expression 48 h after pIRES2-EGFP-YY1 transfection to 293FT cells

3 讨论

GBP5 作为病原体感染激活的相关效应分子，在机体免疫应答中发挥重要的生物学作用［8］。研究报道，在弗朗西斯菌感染机体前期，GBP5 通过调控黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）炎性小体的组装，增强宿主对病原菌的抵抗能力［9］。GBP5是干扰素诱导巨噬细胞活化的标志物之一［10］，同时激活表达的GBP5也可参与调控干扰素通路、促进ISG的表达，从而抑制病毒的复制［11］。

GBP5基因启动子功能和特性的确定对进一步深入研究GBP5 的生物学功能具有重要意义。启动子作为基因表达的“开关”，具有调控基因表达时间及强度的功能，而转录因子则是控制“开关”的把手，调控启动子活性。YY1 属于GLI-Kruppel 锌指蛋白家族，是一种多功能转录因子，具有双重转录活性，参与调控多种基因的转录表达［12-15］。由于所处环境和结合蛋白因子的不同，YY1 在调节基因表达时既可作为抑制因子，也可作为激活因子［16-19］。已有研究发现，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）介导Src-p38 MAPK-YY1信号通路的活化，诱导胶质瘤细胞中GBP1 的表达，促进胶质瘤细胞生长［20］。目前有关 YY1 结合GBP5启动子调控GBP5 表达的生物学活性尚未见报道。本研究通过构建GBP5启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因重组质粒，发现GBP5核心启动子区域位于5′UTR上游-1 623 ～-520 bp，同时过表达YY1后，重组质粒荧光素酶活性明显增强，表明YY1能影响GBP5的启动子活性，提示YY1是调控GBP5表达的潜在转录因子。本研究为深入阐明GBP5基因的表达调控机制奠定了基础，也为明确GBP5的生物学功能提供了实验依据，后续将进一步探究YY1调控GBP5表达的相关信号通路。