糖尿病视网膜病变“代谢记忆”与线粒体功能相关性研究进展△

张媛媛 李筱荣 邵 彦

从21世纪以来糖尿病慢慢进入到人们的视野中,它的主要特征为慢性高血糖[1]。国际糖尿病联盟(IDF)最新数据显示:全球约有5.37亿成年人(20～79岁)患有糖尿病。预计到2030年,这一数字将增加到6.43亿,到2045年将增加到7.83亿[2]。其中,糖尿病视网膜病变(DR)是由DM引起的危害性极大的眼底病变,也是成年人视力丧失的重要原因之一[3]。DR通常可被分为两大类型,即增生型DR和非增生型DR,而糖尿病性黄斑水肿则可以出现在增生型DR[4]。多项研究证实,由于“代谢记忆”效应,在后续血糖正常的情况下,“高血糖记忆”可以继续引发微血管持续和进行性改变。造成“代谢记忆”现象的机制假说众多,线粒体机制是其中之一,目前仍在探索之中。线粒体是能量代谢的核心,而糖尿病是一种能量代谢失衡性疾病。因此,在本文中我们主要讨论DR患者线粒体损伤与“代谢记忆”的联系。

1 “代谢记忆”现象的提出

DR患者的生存质量受其病情严重程度的影响,并与其血糖水平控制的状况密切相关[5]。血糖水平控制较好者发生并发症的风险显著降低。如果患者的血糖水平难以及时恢复到正常或不能持续处于稳定状态,即使日后采取强化治疗方案,其慢性并发症和血管性疾病仍会持续且难以逆转。这一现象的存在加大了对此类疾病的治疗难度,学界称其为“代谢记忆”现象[6]。该现象最早是在两项独立研究中被发现并提出。首先由美国糖尿病控制和并发症研究(DCCT)于1983年开始,将1 441例1型糖尿病患者随机分配接受强化或常规治疗后平均随访6.5年[7]。实验正式开始后将患者随机分为两组,每天注射胰岛素3～4次为强化治疗组,每天注射1～2次为常规治疗组[8-9]。研究人员对两组患者进行了为期约10年的观察后,又对其微血管并发症情况进一步分析发现:与常规治疗组相比,强化治疗组大幅度降低了并发症的风险。于是在1993年停止原实验,将原来接受常规治疗的患者改变为继续接受强化治疗。随即又开启了糖尿病干预与并发症流行病学研究(EDIC)的观察阶段研究[7],该阶段一直持续到2005年2月1日。其中共有1 375名DCCT受试者自愿参加 EDIC,研究目标之一是比较DCCT期间提供的强化或常规治疗对更晚期DR发展的长期影响。在结束对DCCT队列4年的长期随访后,该研究表明在同一个患者队列中,先前强化治疗组和常规治疗组间视网膜病变结果显现出差异。在先前DCCT实验被分为常规治疗组的患者中,无论何种程度的DR和糖尿病性黄斑水肿发生率都显著高于先前强化治疗组的发病率[10]。根据EDIC随访期间获得的可信数据,充分证明了DCCT强化治疗存在长期且持续的益处。经过6.5年的常规治疗与强化治疗后发现,“代谢记忆”现象对患者微血管并发症具有长期、持续的影响。英国前瞻性糖尿病研究(UKPDs)及其后续实验和多个大型临床研究及动物实验均已证实了DM“代谢记忆”现象。

2 DR患者线粒体功能损伤

DR是一种多因素疾病,其特征为高血糖、炎症、微血管损伤和血管通透性增加等。持续的高血糖会导致细胞代谢失衡,而线粒体氧化应激是代谢紊乱的主要因素,也是影响DR患者机体功能的重要因素之一[11]。线粒体作为体内“能量工厂”源源不断地为机体输送能量,在线粒体内膜上电子按氧化还原电位从低向高传递。在传递的过程中,电子通过氧化磷酸化释放能量,95%的氧气被用于合成机体生存所需的ATP,与此同时电子传递链(ETC)也会释放出少量由氧气还原形成的活性氧(ROS)[12-13]。已有许多研究证实,高糖环境可以影响线粒体功能进而影响细胞功能,一方面因为线粒体是生物体内进行氧化还原反应及合成ATP的场所,其功能受到糖尿病患者机体内高血糖状态的影响[14];另一方面,线粒体通过能量代谢影响细胞命运,包括干细胞的静止、自我更新以及分化和衰老[15]。氧化应激是指机体内ROS过量产生或机体抗氧化能力不足的一种相对不平衡状态,它是引起线粒体功能障碍的主要原因。高糖引发一系列分子、生化和功能异常,影响许多代谢途径,包括多元醇途径通量增加、蛋白激酶C亚型激活、细胞内晚期糖基化终末产物形成增加、乙糖胺途径通量增加等多条与氧化应激相关通路的改变都与ROS产生伴随抗氧化防御系统失衡有关[16-17]。视网膜是体内代谢活跃的组织,在高循环葡萄糖的作用下,视网膜细胞中线粒体提高了超氧化率与转化率,过量的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸流向线粒体呼吸链,线粒体机体氧化应激反应加强[18]。持续高血糖环境会影响视网膜毛细血管中内皮细胞的功能,使细胞之间的连接不再紧密,血管通透性增加。液体渗漏并积聚在视网膜中[19]。内皮细胞凋亡、坏死导致视网膜局部炎症和微血管功能障碍,进一步导致视网膜视觉神经细胞的损伤而引起视觉功能受损甚至失明。锰超氧化物歧化酶是一种线粒体超氧自由基清除酶,在生理条件下通过清除自由基防止ROS导致的细胞氧化损伤,保护生物系统免受危害[20]。但在病理情况下,当高血糖等某些因素作用于细胞时,由于锰超氧化物歧化酶的活性显著下降,视网膜细胞线粒体产生过量的ROS不能及时清除[21]。而视网膜是机体耗氧量最多的组织,因此更易受到ROS的损伤,当ROS产生过量时,视网膜氧化应激增加,线粒体功能紊乱,进而引起视网膜毛细血管细胞凋亡等一系列视网膜组织细胞功能损伤。

3 mtDNA氧化损伤介导“代谢记忆”现象

线粒体在细胞代谢中具有重要作用,已有研究证明线粒体DNA(mtDNA)损伤与衰老和多种人类代谢疾病相关[22-23]。MtDNA同时受核DNA(ntDNA)和线粒体基因组的双重遗传调控。但与ntDNA不同,mtDNA没有组蛋白,而是以类核苷结构的形式打包[24-26]。由于缺乏保护性组蛋白,mtDNA相较于ntDNA更容易发生突变,其突变主要由氧化应激损伤造成。过量的ROS可扰乱mtDNA的复制,使线粒体肿胀和破裂,进而释放细胞色素C,导致线粒体功能障碍和细胞凋亡,使患者出现微血管损害及血眼屏障破坏。研究表明,ROS会损伤DR患者血管内皮细胞DNA等大分子物质,线粒体中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的水平升高,mtDNA变异增加[27-28]。常见的mtDNA突变类型包括点突变、核酸修饰和大规模缺失,上述突变都会导致线粒体功能障碍和细胞凋亡[29-31]。

mtDNA的生物合成主要依赖于线粒体DNA聚合酶γ(POLG)和线粒体转录因子A(TFAM)[32]。对于mtDNA的复制,除了POLG外,Twinkle也作为一种复制解旋酶发挥着重要作用[33]。POLG和Twinkle共同形成复制体结合、解开和延伸mtDNA,这一过程利用RNA聚合酶合成的RNA短链(RNA引物)来制造新的互补mtDNA链[34]。DR患者视网膜细胞中POLG和Twinkle的表达下降、线粒体数量显著减少,线粒体运输系统受损导致线粒体功能障碍[35]。TFAM是参与mtDNA转录激活和调节mtDNA拷贝数的重要因子,在DR病程进展过程中,由于氧化应激等原因造成视网膜线粒体中TFAM的水平降低,导致mtDNA生物合成受损及拷贝数目不正常[36-37]。当mtDNA发生大片段缺失或点突变时,与编码氧化呼吸链复合物相关的线粒体基因可能会受到破坏而出现表达缺陷,导致线粒体氧化磷酸化过程受损[38-39]。

mtDNA存在一个非编码区位移环(D-loop),它是起始转录和复制的位点。在DR患者中,与mtDNA的其他编码区相比,D-loop区更易发生损伤和序列变异[40]。此外相较于ntDNA,mtDNA不仅容易发生氧化损伤且修复机制也容易受到破坏[41-42]。虽然线粒体具有高效的DNA修复机制,包括ntDNA编码的碱基切除修复酶(BER)和错配修复酶(MMR),但是糖尿病环境导致线粒体运输系统运输修复酶的能力下降,进一步减弱了修复损伤机制的能力[38]。由于复制和修复系统均遭到破坏,mtDNA无法修复至正常水平。mtDNA突变导致线粒体功能障碍受到了越来越多的关注,而线粒体基因缺陷也赋予了个体一定的糖尿病遗传易感性[43]。

4 mtDNA甲基化介导 “代谢记忆”现象

DNA甲基化加剧线粒体损伤,并被指出有可能是DR进展乃至“代谢记忆”现象形成的主要因素。DNA甲基化是哺乳动物基因组中最早发现且最为常见的修饰途径,它是由DNA甲基转移酶(DNMT)催化,以甲硫氨酸为供体,将甲基转移到胞嘧啶的第五个碳原子上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。正常的DNA甲基化被认为对于维系细胞的生理功能及代谢等是必不可少的,它能够改变遗传表观但不改变DNA序列。而异常的甲基化则会诱发基因组失衡而引起病变。

在DR的进展过程中,视网膜mtDNA高度甲基化,而POLG调控区的高甲基化会导致mtDNA复制功能失调,自此形成视网膜毛细血管细胞凋亡[44-45]。研究表明,糖尿病环境有益于5mC的CpG岛的甲基化过程,而5mC的突变率很高,极易在DNA中产生碱基错配或突变[46-48]。此外,视网膜错配修复蛋白Mlh1和POLG启动子区域的DNA高度甲基化和DNA甲基转移酶1(DNMT1)的结合增加,导致mtDNA错配修复受损,线粒体DNA拷贝数减少。由于mtDNA甲基化增加,对ETC系统功能起重要作用的mtDNA编码基因的转录减弱,ETC继续受损。同时,抑制mtDNA甲基化可以减少糖尿病引起的D-loop区错配,而mtDNA甲基化增加则会导致碱基错配率升高[49]。以上研究证明,mtDNA甲基化的改变与线粒体内功能障碍之间存在着密切的联系。高糖环境和氧化应激反应使DR患者视网膜mtDNA发生改变,由于基因是动态变化的,它能够对高糖环境的刺激作出反应,发生表观遗传学修饰如甲基化等。即使在高血糖终止后,mtDNA甲基化带来的改变仍在继续[5,50]。因此,针对修复mtDNA突变及改善功能损伤的策略可以作为阻止DR发生和进展的潜在疗法。

5 结束语

本文阐释了在DR患者中普遍存在高血糖“代谢记忆”现象,且“代谢记忆”是DR持续进展的重要原因,该现象的存在与线粒体功能受损密切相关。由于DR患者长期处于高血糖和氧化应激的状态下,造成ROS过量堆积。当过量ROS形成的恶性循环与mtDNA突变、表观遗传学等因素交织在一起,导致体内形成无法擦除的“记忆现象”。即使通过逆转高血糖,也无法迅速完全阻止mtDNA损伤带来的恶性循环。针对mtDNA突变损伤及线粒体功能破坏这一原理,最新研究发现线粒体转移能在线粒体功能和代谢功能重建中发挥关键作用,被认为在代谢性疾病的治疗中具有巨大的潜力。线粒体转移将为代谢相关性疾病(如糖尿病、代谢紊乱等)、中枢神经系统疾病(帕金森病、抑郁症、精神分裂症等)、外周系统疾病(缺血性心肌损伤、脂肪肝、肺气肿等)和肿瘤等疾病的治疗开辟了新的途径,提供了新的手段。