基于稳定同位素与矿物元素指纹特征的金银花产地溯源研究

魏静娜 李 安 张 强 赵云平 赵琳琳 苏 蘩孙 萌 刘征辉

（1.天津市农业科学院农产品质量安全与营养研究所，天津 300381；2.天津海世达检测技术有限公司，天津 300381；3.北京市农林科学院质量标准与检测技术研究所，北京 100097）

金银花为忍冬科植物忍冬（LonicerajaponicaThunb.）的干燥花蕾或带初开的花，其含有丰富的黄酮类、环烯醚萜类、有机酸类[1]、皂苷类及挥发类成分[2～5]， 具有解热、 抗炎[6]、 抗菌[7]、 抗病毒[8]、护肝利胆、增强免疫力[9]、促进胃肠蠕动[10]等作用[11～12]。金银花及含有金银花组分的成药可以通过多个靶点，改善新型冠状病毒肺炎（COVID-19）引起的免疫系统紊乱、炎症等，并且可以通过人类与病毒之间的蛋白相互作用直接影响新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的感染过程，起到抗病毒和防治COVID-19的作用[13～15]。

金银花由于具有较高的经济价值及很强的适应性，在我国很多省份均有种植。但金银花作为中药材，其质量与产地密切相关，由于土壤、气候、温度、光照等生态因子的不同，药材品质上会有差异[16]。道地药材无序异地移栽是造成药材质量下降、“古方失效”的重要原因[17]。研究金银花的产地溯源技术，不仅有利于研究分析不同产地金银花药材的药效偏向，而且可用于金银花药材异地移植效果的评价。目前，文献报道用于金银花产地识别的方法有近红外光谱法[18～22]、指标成分含量测定法[23]、液相色谱指纹图谱法[24～25]、分子标记技术[26]等。

稳定同位素技术是依据不同产地的大气、土壤、水等环境中含有生源要素同位素组成存在差异，且生物体内的同位素受气候、环境和生物代谢类型等因素的影响，导致不同种类及不同地域来源的生物体中同位素自然丰度存在差异，通过利用这种差异来区分其可能产区的一种先进技术[27]。植物体内的矿物元素组成与其生长环境中的水、土壤、大气、气候及根区微生物等密切相关[28]，矿物元素指纹分析技术也是用于植物源性药材产地鉴别的有效技术[29～30]。

单一的同位素技术对大尺度区域植物样本的产地鉴别效果良好，对小尺度区域植物样本的产地鉴别效果略差[31～32]，采用多技术、多指标联合进行产地的精确溯源是当前的发展趋势。本研究拟利用稳定同位素技术联合矿物元素指纹分析技术，建立华北地区小尺度空间下的金银花产地溯源模型，用于金银花异地移植效果的评价，并为金银花产地溯源检测技术体系的构建提供参考。

一、材料与方法

（一）试剂稳定同位素标准物质USGS40（δ13CVPDB-LSVEC＝-26.39‰；δ15NAIR＝-4.52‰）、USGS 45（δ2HVSMOW＝-10.3‰；δ18OVSMOW＝-2.238‰）、USGS 46（δ2HVSMOW＝-235.8‰；δ18OVSMOW＝-29.8‰）和USGS 47（δ2HVSMOW＝-150.2‰；δ18OVSMOW＝-19.80‰）均为美国地质勘探局Reston稳定同位素实验室研制。

（二）仪器MAT 253稳定同位素比值质谱仪、Flash 2000元素分析仪，美国赛默飞世尔公司；XP6微量天平，瑞士梅特勒托利多公司；GM200研磨仪，德国莱驰公司；Agilent 7900电感耦合等离子体质谱仪，美国安捷伦公司。

（三）材料本研究采集的金银花样本，均采收于2019年5-6月，采集地点包括北京、天津、河北、山东和河南5个产区，共159份，详细样本信息见表1。所有样本均经过北京中医药大学李卫东研究员鉴定，确认为忍冬的干燥花蕾或带初开的花。将采集的每份样品充分混匀后，利用研磨仪充分研碎，分装成3份，备用。

（四）稳定同位素比值测定

1.碳、氮稳定同位素比值的测定。称取约0.8 mg待测样品，用锡杯包好后置于元素分析仪自动进样盘中。样品在960℃高温下燃烧，并在三氧化二铬的作用下氧化成二氧化碳（CO2）和氮氧化物，氮氧化物经铜还原成氮气（N2），即样品中的碳（C）和氮（N）元素转化成CO2和N2。在氦气（He）载气流和色谱柱吸附解吸后，N2和CO2先后进入稳定同位素比值质谱仪进行同位素比值的测定。以USGS40为标准物质，采用单点校正的方式对测试结果进行校正。

2.氧稳定同位素比值的测定。称取约0.2 mg待测样品，用银杯包好后置于元素分析仪自动进样盘中。样品在1 400℃下，在玻璃碳珠催化作用下裂解为氢气（H2）和一氧化碳（CO），即样品中的氢（H）和氧（O）元素转化成H2和CO气体。在氦气载气流和色谱柱吸附解吸后，H2和CO先后进入稳定同位素比值质谱仪进行同位素比值的测定。以USGS45、USGS46和USGS47为标准物质，采用3点校正的方式对测试结果进行校正。

元素分析-稳定同位素比值质谱仪的具体参数为氦气载气流速100 mL/min；氦气吹扫气流速100 mL/min；C、N燃烧炉温度960℃；O裂解炉温度1 400℃。稳定同位素比值按照公式（1）计算。

公式（1）中，R样品为测试样品中重同位素与轻同位素丰度比值，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R标准为国际标准样的重同位素与轻同位素丰度比值，其中δ13C以国际标准V-PDB为基准，δ15N以大气为基准，δ18O以平均海洋水为基准。

（五）矿物元素的测定

1.样品消解。称取0.3 g（精确到0.001 g）样品粉末于50 mL微波消解罐中，加入8 mL硝酸，加盖放置过夜，装入消解外罐，放入微波消解炉转盘上，消解条件参考GB 5009.268-2016标准[33]，具体为从室温升至120℃（5 min），保持5 min，再从120℃升至150℃（5 min），保持10 min，最后从150℃升至190℃（5 min），保持20 min。消解结束后取出消解罐，缓慢打开罐盖进行排气，将消解罐放在控温电热板上，于100℃加热30 min后，加水定容至25 mL，待测。试剂空白和国家标准物质GBW10019按上述方法同时进行处理。

2.仪器工作参数。调谐模式为He模式；射频功率为1 550 W；RF匹配为1.40 V；采样深度为10.0 mm；雾化气流量为1.05 L/min；蠕动泵速度为0.30 r/s；雾化室温度为2℃；提取透镜1电压为0 V；提取透镜2电压为-210 V；Omega偏转电压为-110 V；Omega透镜电压为10.4 V；碰撞池入口电压为-40 V；碰撞池出口电压为-60 V；Deflect为0.2 V；Plate Bias为-55 V；He气流量为5.0 mL/min；八极杆偏转电压为-18 V；八极杆RF为200 V；能量歧视为5.0 V

（六）数据处理各样品对应参数的测定，均设置3个平行试验，应用Excel 2010、SPSS 25.0及SIMCA 14.1软件对数据进行处理分析，各类数据均以“平均值±标准差”的形式表示。

二、结果与分析

（一）数据预处理使用SPSS 25.0将5个产区的3种稳定同位素比值和22种矿物元素的数值，按照产地和参数分组进行标准化处理并绘制箱图，将经过标准化处理后，绝对值≥2的项及箱图中标示出的异常点所对应的原始数据视为异常值，在后续分析中将异常值以组平均值来代替。

（二）不同产地金银花C、N、O稳定同位素比值单因素方差分析 （Analysis of variance，ANOVA）结果显示，C、N、O稳定同位素比值在本研究所涉及的5个产区金银花样本中存在极显著差异（P＜0.01）。采自山东的金银花样本δ13C值，显著高于除天津外其他产地的金银花样本（见表2及图1），根据δ13C值随海拔升高而普遍增加以及随年平均气温降低而升高的趋势[34]，推断可能与山东平邑县金银花种植区的平均海拔更高以及年平均气温稍低一些有关；样品采集地点分布广可能是导致山东的金银花样本δ13C值标准偏差较大的原因之一。植物的肥料添加来源会影响植物体内δ15N值，与人工合成的肥料相比，有机肥中的15N富集明显[34]。天津地区金银花种植过程以有机肥为主要肥料，这可能是导致天津的金银花样本δ15N值明显高于其他地区样本的原因之一。外界环境对植物体内氢、氧同位素组成的影响主要与降水有关，降水中氢、氧稳定同位素存在显著的纬度效应、海拔效应和内陆效应[34]。本研究中各产区金银花样本中δ18O值的分布为多种因素综合作用的结果；山东平邑县金银花样本δ18O值，显著高于其他产区，而北京产区的金银花样本δ18O值跨度范围最大。

图1 5个产区金银花C（A）、N（B）、O（C）稳定同位素比值箱式图

表2 不同产地金银花中C、N、O稳定同位素比值 （‰）

（三）不同产地金银花矿物元素含量不同产地金银花中矿物元素含量水平见表3。单因素ANOVA结果显示，本研究所测定的金银花中22种矿物元素的含量，在各产区间均存在极显著差异（P＜0.01）。

表3 不同产地金银花中矿物元素的含量

（四）基于SIMCA的金银花产地溯源模型构建

1.主成分分析 （Principle component analysis，PCA）。选用SIMCA的PCA-X模型对金银花3种稳定同位素比值 （δ13C、δ15N和δ18O）指标和22种矿物元素指标进行主成分分析，分析结果表明，模型中前5个成分为主要成分，方差解释率累计值R2X（cum）＝0.779，模型预测能力Q2（cum）＝0.586。由前两个成分绘制的得分图（见图2）可以看到，河北和天津的金银花样本中稳定同位素比值和矿物元素含量较稳定，样本点比较集中，山东产区的金银花大致可分为3组；天津产区的金银花样本点可与其他产区完全分开，河南和北京产区的样本点较分散，互相交织在一起，不易区分。结合载荷图（见图3）发现，天津蓟州区的金银花样本中，Se、Sn、Sb、Pb、Hg、Be、Fe、Cr、V、As的含量较高；河北巨鹿产区金银花样本中3种稳定同位素比值及22种矿物元素含量大都处于中间水平。

图2 159批金银花样品的PCA得分图

图3 3种稳定同位素比值及22种矿物元素的PCA载荷图

2.偏最小二乘法判别分析（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）。PLS-DA是多变量数据分析技术中的判别分析法，经常用来处理分类和判别问题，是一种有监督的判别分析法。因无监督的分析方法（PCA）对所有样本不加以区分，即每个样本对模型有着同样的贡献，因此，当样本的组间差异较大，而组内差异较小时，无监督分析方法可以明显区分组间差异；而本研究的PCA结果显示，除天津产区外，其他4个产区的金银花样本中3种稳定同位素比值及22种矿物元素含量的组间差异不明显，而组内差异却较大，无监督分析方法难以区分组间差异。另外，本研究中各产区的样本量相差较大，样本量大的组将会主导模型。有监督的分析（PLS-DA）能够很好地解决无监督分析（PCA）中遇到的这些问题。

综合评价PLS-DA模型的3个指标，模型拟合参数R2X＝0.82，R2Y＝0.699，模型预测参数Q2＝0.64，均大于0.5，说明建立的模型稳定且预测能力较强。与PCA结果相比，经过PLS-DA后，山东样本汇聚状况改善较多，河南和北京的样本点依然相互交织在一起，无法分离（见图4）。

图4 159批金银花样品的PLS-DA得分图

3.正交偏最小二乘法判别分析（Discriminant analysis by orthogonal partial least squares，OPLSDA）。OPLS-DA的最大特点是可以去除自变量X中与分类变量Y无关的数据变异，使得分类信息主要集中在一个主成分中，从而模型变得简单和易于解释，其判别效果和主成分得分图的可视化效果更加明显。与PLS-DA得分图比较，OPLS-DA得分图中，单组样品点聚集更明显，各个产区的样本可以分别较好地聚在一起（见图5）。

图5 159批金银花样品的OPLS-DA得分图

综合评价OPLS-DA模型的3个指标，模型拟合参数R2X＝0.841，R2Y＝0.709，模型预测参数Q2＝0.651，均大于0.5，且略大于PLS-DA模型中对应的参数值，说明建立的OPLS-DA模型稳定及预测能力较PLS-DA模型更强。

变量投影重要性（VIP）值>1的指标是区分各产区金银花的主要差异指标[35]，Hg、K、Zn、Co、δ18O、Ni、As、Mo、Ba、Cu和Cr共11个指标的VIP值>1（见图6），即表明在该模型中，造成不同产地金银花分类差异的成分主要是这11种。

图6 3种稳定同位素和22种矿物元素的VIP值

对所建立的OPLS-DA模型进行200次置换检验，结果见图7。所有5个产地的验证图中，只有北京产区图中最右边的R2值和Q2值较低，但也大于0.4，可以接受，其他产区验证图中，最右边的R2值和Q2值均大于0.5；验证图中所有左边的Q2值均比右边的原始点低，所有左边的R2值也均低于右边的原始点，且Q2的回归线截距均为负值，小于0.05，表明所构建的OPLS-DA模型没有出现过拟合，具有较好的预测能力。

图7 OPLS-DA模型200次迭代计算验证图

（五）基于SPSS的线性判别分析（Lineardiscriminantanalysis，LDA）使用SPSS的Fisher判别函数对金银花产地进行多变量判别分析，以3种稳定同位素比值和22种矿物元素含量作为判别分析的自变量，建立了金银花产区判别模型，分析中使用了前4个典则判别函数［见公式（2）～见公式（5）］。

结构矩阵分析结果表明，第1个函数主要与Hg、As、Sb、Se、δ15N含量相关，第2个函数主要与Cu、K、Mg、δ18O、δ13C、Mn含量相关，第3个函数主要与Cr、Na、Ni、Sn、Ca、Zn、Mo、Cd、Pb含量相关，而V、Fe、Be、Co和Ba的含量则主要与第4个函数关系密切。

特征值分析表明，这4个函数能够解释变量的占比总和达到100.0%，威尔克Lambda显著性检验中，4个函数的Sig.＝0.000＜0.05，进一步证实，在α＝0.05的显著性水平下，4个函数均有统计学意义，其中函数1和函数2的典型相关系数均大于0.9，2个函数累计可解释方差的百分比达到80.8%。将159个样本的判别函数得分作散点图，从散点图可以看出，天津产区的金银花样本点与其他产区完全分开，河南、北京、河北和山东的样本点未能实现两两产区之间完全分离。

根据4个典则判别函数，建立金银花产地判别函数模型，获得的判别函数见公式（6）～公式（10）。

利用所建立的判别模型对5个产区的金银花进行归类，并结合留一交叉检验法对所建模型的有效性进行验证。结果显示，模型对98.7%的原始已分组个案进行了正确分类，对95.0%的交叉验证的已分组个案进行了正确分类（见表4）。在利用所建立的判别模型进行留一交叉验证时，北京、河南和天津的样品正确判别率均为100%，山东的样品正确判别率稍低，但也达到88.2%，说明本研究建立的判别模型可以用于山东、河北、河南、山东、天津5个产区金银花样本的产地溯源分析。

表4 不同产地金银花一般判别分类结果

三、结论

本研究基于3种稳定同位素比值及22种矿物元素建立了北京、河北、河南、山东和天津5个产区的金银花产地溯源模型。由于5个产区距离较近，PCA及PLS-DA均不能很好地将5个产区的样本点分开，而采用OPLS-DA分析，各产区之间的分离情况明显改善，模型验证结果显示，所建立的OPLS-DA模型拟合度较好，可用于5个产区金银花样本的产地区分。使用SPSS建立的判别函数，可以对98.7%的原始已分组个案进行正确分类，对已分组个案交叉验证，正确率也达到95.0%。本研究中采集的金银花样品，尽管品种、干燥方式、花期等均有所不同，但OPLS-DA分析中，同一产区的样品均能较好地聚在一起；线性判别分析中建立的Fisher判别函数也可以有效地实现金银花样本的产地区分，说明利用稳定同位素和矿物元素相结合的技术，可以有效实现小尺度空间内金银花样本的产地溯源。