黏玉米谷氨酰胺酶的酵母表达及其对乳蛋白的作用

韩秀娥，秦兰霞，任浩威

（东北农业大学食品学院 哈尔滨 150030）

谷氨酰胺转胺酶（TGase）能催化蛋白质与多肽链中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基与一级氨基之间的酰胺基转移反应，即催化蛋白质之间的交联反应[1-7]。 TGase 作用的底物包括乳清蛋白、麦胚蛋白、大豆蛋白、牛肌球蛋白和家禽肌动球蛋白等[7-20]。在乳制品中，其能提高奶酪的产量、酸奶的品质；在肉制品和鱼制品中，可以改善产品的外观和质构；并通过引入赖氨酸提高蛋白质的营养价值，使蛋白类食品在营养、质构、外观和风味等方面得到改善，满足人们日益增长的对食品的口感、风味和营养的需求[21-29]。 随着食品工业的蓬勃发展，对食品添加剂的需求量也逐年增加，而谷氨酰胺转胺酶是蛋白质，作为食品添加剂可以直接被人体消化吸收，与其它人工合成添加剂相比，具有无法比拟的优越性[29-35]。 本文研究的TGase，是理想的天然食品添加剂，可以替代目前使用的人工食品添加剂。目前，谷氨酰胺转胺酶在中国食品工业中还没有得到广泛应用，主要是由于产量与来源受限，不能满足市场需求。 急需获得1 株高产谷氨酰胺转胺酶的菌株。

本研究目的是利用生物化学和分子生物学的技术和手段，克隆玉米氨酰胺转胺酶基因，将其连接入毕赤酵母表达载体，并在酵母中表达，筛选获得高产菌株，并对酶的生物功能特性进行研究。采用酶技术来改善传统蛋白食品的功能特性和营养特性，具有极大的发展潜力。 这是因为酶反应专一，条件温和，易于控制，越来越受到食品领域的重视。应用生物酶制剂进行蛋白质的生物改性，提高食品的营养、质构、风味，是未来发展趋势。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115 和质粒酵母表达载体pPIC9K-TGase 由东北农业大学乳品重点实验室保存；酵母基因组DNA 提取试剂盒，TIANGEN（中国）；ExTaq DNA 聚合酶、EcoR I、Not I、Sac I，中国大连TaKaRa 公司。胰蛋白胨、酵母提取物，OXOID 公司（英国）；异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），中国上海华舜生物工程有限公司；N'N'亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠（SDS）、Tris-Base、四甲基已二铵（TEMED）、二硫苏糖醇（DTT）、过硫酸铵（APS）、甘氨酸、酵母氮源培养基（YNB），GIBCO 公司（美国）；蛋白分子量标准，Fermentas；TritonX-100、EB（溴化乙锭），Sigma 公司（美国）。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pPIC9K-TGase 的PCR 鉴定 以质 粒pPIC9K -TGase，以上游引物：5' -ATC GAATTCATGGCTCATCGTGGACATCTAGA-3' 和下游引物 ：5' -GTCAGCGGCCGCGATTTCAC CATATTTGTCTGC-3'为引物进行PCR 扩增，扩增片段长度为1 630 bp。 使用高保真的ExTaq DNA聚合酶，进行PCR。条件为：94 ℃2 min，94 ℃35 s，62 ℃40 s，72 ℃100 s，29 个循环；72 ℃ 延伸11 min。 反应结束，用1%的琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定。

1.2.2 质粒pPIC9K-TGase 的双酶切鉴定 用EcoR I 和Not I 双酶切质粒pPIC9K-TGase。 酶切反应条件：37 ℃酶切2 h。反应结束后，取酶切产物5 μL 进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯光下观察电泳结果并拍照。

1.2.3 质粒pPIC9K-TGase 的线性化及电转化 将经酶切、PCR 鉴定后的重组表达质粒pPIC9KTGase，用Sac I 进行单酶切线性化反应。 然后，将线性化产物电转化至感受态细胞毕赤酵母GS115中。 取转化物均匀涂布于含100 μg/mL 博莱霉素（Zeocin）的YPDS 选择平板上。

1.2.4 粘玉米TGase 基因在酵母中的表达 接种一单菌落到25 mL 的BMGY 培养基中，培养到OD600nm=2～6；离心（12 000 r/min，10 min），收集细胞，移入BMMY 培养基中，置28 ℃遥床培养；每24 h 向培养基中添加100%甲醇，使其最终体积分数达0.5%； 每隔一段时间取样1 mL 分析表达水平，以确定最佳诱导时间。取样时间点为（h）：0，24（1 d），48（2 d），72（3 d），96（4 d）；在样品中加入100 μL ddH2O，混匀并加入25 μL 5×SDS 凝胶加样缓冲液，混合20 s。 样品经沸水浴处理后进行SDS-PAGE 电泳分析。

1.2.5 酵母表达产物的纯化 将酵母工程菌GS115/pPIC9k-TGase 诱导表达，培养液（BMMY）4℃10 000 r/min 离心10 min，将上清液上样于经50 mmol/L，pH 5.0 磷酸钠缓冲液预平衡的SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析柱，然后以含0.2 mol/L 氯化钠的0.02 mol/L pH 6.5 的磷酸钠缓冲液梯度洗脱，收集含目的蛋白的洗脱液，凝胶过滤后，收集到的活性峰溶液较稀，离子强度大，需经过浓缩和透析，经0.02 mol/L pH 6.5 的磷酸钠缓冲液透析后，采用阳离子交换柱HiPrep16/10 纯化，平衡缓冲液为0.02 mol/L pH 6.5 的磷酸钠缓冲液，上样结束后用平衡液洗至基线，进行氯化钠梯度洗脱，以含0.2 mol/L 氯化钠的0.02 mol/L pH 6.5 的磷酸钠缓冲液梯度洗脱。收集含目的蛋白的洗脱峰。 以考马斯亮蓝染色法对纯化后的目的蛋白进行浓度测定，SDS-PAGE电泳。

1.2.6 酵母表达的TGase 对酪蛋白的改性 取0.2%（体积分数）pH 6.5 的酪蛋白溶液2 mL，纯化的TGase 酵母表达蛋白浓缩液2 mL，于37 ℃反应2.0 h，取60 μL 反应液，加入等体积的2×SDS 样品缓冲液，沸水浴6 min，然后进行SDS-PAGE 凝胶电泳。

1.2.7 酵母表达的TGase 对酸奶超微结构的改变

酵母表达的TGase 按一定比例加入酸奶中，以不加TGase 为对照，于43 ℃恒温箱中进行保温发酵，大约2.5 h 后，pH 值达到4.7 左右时，停止发酵，在4 ℃冰箱中贮存待用。 然后，按要求制作电镜样品，在扫描电镜下观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pPIC9K-TGase 的双酶切鉴定

将pPIC9K-TGase 质粒转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，提取质粒用EcoR I 和Not I 双酶切鉴定，鉴定结果如图1 所示。

图1 重组质粒pPIC9K-TGase 的双酶切鉴定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pPIC9K-TGase by double digestion

2.2 重组质粒pPIC9K-TGase 的PCR 鉴定

以质粒pPIC9K-TGase 为模板，以TGase-up和TGase-down 为引物进行PCR 扩增，电泳结果见图2，扩增的DNA 条带大小约为1 630 bp，与预期大小相符。结果表明，目的基因已插入到表达载体pPIC9K 中。

图2 重组质粒pPIC9K-TGase 的PCR 鉴定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid pPIC9K-TGase

2.3 重组酵母的诱导表达

与对照组比较，重组菌诱导表达上清液在分子质量约60 ku 处，有明显特征性条带出现（图3中箭头所示），与预期的TGase 分子质量大小相符，表明TGase 蛋白在酵母中得到表达。通过对蛋白浓度计算，培养基中目的蛋白表达量为85 mg/L，酶活为6.5 U/mL。

图3 酵母转化子表达上清SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of yeast transformant expressing supernatant

2.4 重组蛋白的纯化

酵母工程菌GS115/pPIC9k-TGase 表达的上清，经SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析柱，阳离子交换柱HiPrep16/10 纯化后，上样于聚丙烯凝胶上进行SDS-PAGE 电泳，结果见图4。酵母工程菌GS115/pPIC9k-TGase 培养液上清，经凝胶过柱后，可以得到纯化蛋白。 经薄层扫描分析，纯化蛋白的纯度可达85%。

图4 纯化蛋白的SDS-PAGE 电泳Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis of purified proteins

2.5 毕赤酵母表达的TGase 对酪蛋白的改性

毕赤酵母表达的TGase 对酪蛋白具有很强的聚合作用，使酪蛋白交联成较大的聚合物，很大部分聚集在浓缩胶和分离胶的界面，小部分形成了不同分子质量的蛋白聚合物，分布在分子质量在45 ku 以上，结果见图5。

图5 酵母表达的TGase 催化酪蛋白聚合反应Fig.5 Casein polymerization catalyzed by TGase expressed by yeast

2.6 毕赤酵母表达的TGase 对酸奶超微结构的改变

将酵母表达的TGase 加入酸奶中，酸奶样品经处理后，放于扫描电镜下观察。 结果见图6a 和图6b，放大倍数为5 000 倍。由图6a 可知，没有加酶的酸奶形成大孔径的纤维网络结构，这些网络结构是由变性的酪蛋白微粒以丛状、 链状连接在一起堆积而成，这些微孔的直径一般在9 μm 以上；图6b 可见，添加酵母表达的TGase，网络结构变得较致密，空隙直径在3 μm 左右。

图6 酸奶的超微结构Fig.6 Ultrastructure of yogurt

3 结论

本研究将前期已经构建好的重组质粒pPIC9K-TGase 经双酶切及PCR 鉴定正确后，Sac I 线性化处理，电转入巴斯德毕赤酵母GS115，利用1%（体积分数） 甲醇诱导其分泌表达。 SDSPAGE 电泳可检测到特异的蛋白带。 通过对蛋白浓度的计算，培养基中目的蛋白表达量为85 mg/L，酶活为6.5 U/mL。通过酪蛋白改性试验证明：毕赤酵母表达的TGase，都能使酪蛋白聚合生成不同分子质量的聚合物；通过扫描电镜观察：添加酵母表达TGase 的酸奶凝胶网络结构变得较致密，孔隙也变得较小。