洋甘菊残渣抑菌活性及作用研究

岳明，阿迪拉·阿布都热西提，尼格尔热依·亚迪卡尔，*，李明璇，丽娜·托兰

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆特色药食用植物资源化学实验室，喀什大学，新疆 喀什 844000）

菊科植物是我国著名的中草药，有着悠久的药用历史及较高的药用价值，同时又被广泛应用于茶饮。有较多学者已发现菊科植物提取物具有较强的抑菌作用[1]，其中洋甘菊头状花序中精油及黄酮类化合物的抗菌消炎活性较强。德国洋甘菊，母菊属，为一年生草本植物，学名为Matricaria chamomilla L.，植物名为Matricaria recutita[2]，原产于欧亚大陆北部和西部，在我国新疆地区种植较多。

抗生素耐药性是当代医学面临的一个的问题，己成为21世纪新型全球性公共健康议题之一，在许多国家抗生素耐药性己存在危害人类健康的隐患[3]。因此迫切需要寻找开发新型抑菌治疗剂以补充我们的抗感染药物群体。天然产物具有多种生物活性，为细菌性感染疾病的治疗提供了新的方向与思路，植物抗菌药应用于临床己越来越普遍[4]。林碧芬[5]对蟛蜞菊的挥发油、95%乙醇提取物和水提物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位分别进行抑菌活性研究，结果表明95%的乙醇提物的石油醚和乙酸乙酯萃取部位抑菌作用较强。王秋红等[6]对线叶菊采用了微量稀释法，探究线叶菊的非挥发性部位对临床常见的12种病原菌的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC），结果表明线叶菊的非挥发性部位对耐药金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强；陈红兵等[7]研究发现万寿菊乙酸乙酯提取液对青霉、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有较强的抑菌作用。蟛蜞菊、线叶菊、万寿菊都属菊科植物，其非挥发性成分中极性物质均具有抗菌活性。

本试验对洋甘菊残渣进行成分分析，以显色法进行成分鉴定并测定相应含量；通过洋甘菊残渣各极性部位对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌的抑制作用，完善对洋甘菊各极性部位抑菌活性的研究；并测定乙酸乙酯萃取物处理后的金黄色葡萄球菌的生长曲线、电导率、细胞完整性、胞外蛋白、胞外多糖，探究洋甘菊残渣的抑菌机制，以明确新疆产洋甘菊残渣作为天然抑菌剂、防腐剂的潜在应用价值，促进新疆地区菊资源的深度开发与高值化利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

洋甘菊：新疆和田地区于田县，经水蒸气蒸馏法提取精油后得到洋甘菊残渣；金黄色葡萄球菌ATCC 25923（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌 ATCC 25922（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌ATCC 9327（Bacillus subtilis）、铜绿假单胞菌ATCC 9027（Pseudomonas aeruginosa）：新疆农业大学食品科学与药学学院微生物实验室。

琼脂粉、酵母浸粉、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；碱式磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）试剂盒：南京建成生物工程研究所；氯化钠、石油醚、氢氧化钠、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、浓盐酸、镁粉、三氯化铁、三氯化铝、硝酸铝、硝酸钠、溴水、碳酸钠：天津致远化学试剂有限公司；试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-IFD型超净工作台、YXQ-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司；RE-52型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHB-III型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；ZWY-200D型恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；DNP-9052A型电热恒温培养器：上海冠戈实业有限公司；UV-1200型紫外可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；DZTW型电子调温电热套：北京市永光明医疗器械厂；DDS-307型微机型电导率仪：上海雷磁仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

样品制备参考李晨等[8]方法并略作修改。将提取过精油的洋甘菊残渣放置阴凉处晾干，称取适量用渗漉法浸泡，按照料液比为1∶20（g/mL）的比例加入75%乙醇溶液浸没，浸泡48 h后渗漉提取，将提取液浓缩烘干，得到总提物浸膏，重复提取3次～5次。将总提物浸膏用蒸馏水进行超声分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每种溶剂萃取3次～5次，浓缩后回收萃取溶剂，分别得到石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物，将每种提取物蒸干后，备用。

1.3.2 培养基的配制

LB液体和固体培养基配制参考綦国红等[9]的方法。

1.3.3 菌种的活化与菌悬液制备

分别挑取4种供试菌株的单个菌落于LB液体培养基中进行活化，置于37℃恒温振荡培养18 h～24 h，用灭菌生理盐水将活化好的供试菌株稀释成浓度为106CFU/mL～107CFU/mL的菌悬液，4℃保存备用。

1.3.4 洋甘菊残渣中化合物的鉴定

采用三氯化铁试验和溴试验，鉴定洋甘菊残渣不同极性部位中的酚酸类化合物。取样品1 mL加入三氯化铁试液1滴～2滴，若颜色变为蓝紫色，说明其中有酚酸类化合物；取溴水溶液1 mL加入1滴～2滴样品的水溶液，若有白色沉淀生成，说明样品中含有酚酸。

采用Molisch试验，鉴定洋甘菊残渣不同极性部位中的多糖。取待测液1 mL，加入2滴α-萘酚试剂充分混合，将试管倾斜沿管壁慢慢加入1 mL浓硫酸，把试管缓慢立起，不摇动，若在两相交界处有紫红色环出现，则说明样品中含多糖。

采用盐酸镁粉试验和三氯化铝试验，鉴定洋甘菊残渣不同极性部位中的黄酮类化合物。在样品的乙醇溶液中加入少许镁粉后滴入1滴～2滴浓盐酸，等待1 min～2 min，形成有颜色的络合物；将1%三氯化铝滴入1 mL样品中，观察溶液若生成物为黄色且有荧光，则证明样品中含有黄酮类化合物。

1.3.5 洋甘菊残渣化学成分含量测定

酚酸成分含量、多糖成分含量、黄酮成分含量测定均参考成宏斌等[10]的方法。

1.3.6 洋甘菊残渣各极性部位抑菌活性的测定

1.3.6.1 最小抑菌浓度测定

采用二倍稀释法测定洋甘菊分极萃取的各相提取物的最小抑菌浓度。根据张赟彬等[11]方法并略做改动。分别向每个试管中加入100 mL菌悬液，将洋甘菊残渣4种溶剂萃取物分别用浓度为0.2%的二甲基亚砜配制成 500、250、125、62.5、31.25、15.625 mg/mL，分别取2 mL洋甘菊残渣4种溶剂萃取物加入菌悬液的试管中。在37℃、200 r/min的生物摇床中培养24 h。观察各个试管的颜色变化，结果以肉眼可见菌落生长的最小质量浓度为其萃取物的MIC[12]。

1.3.6.2 抑菌圈测定

采用打孔法测定洋甘菊分极萃取的各相提取物的抑菌圈大小。根据曾兰君等[12]方法并略做改动。分别取适量4种菌悬液于灭菌的培养皿中，倒入50℃左右灭菌过的LB固体培养基，厚度约为4 mm，轻轻摇晃混匀，待其冷却凝固成型后，用灭菌后直径为6 mm的金属打孔器在平板表面打4个孔，将孔内固体培养基挑出，向每个孔中加入适量的4种萃取物的样品，对照品为二甲基亚砜。将各培养基置于37℃的培养箱中，培养18 h～24 h。采用十字交叉法测量抑菌圈直径大小，抑菌圈直径取3个平行样的平均值为测定结果。

1.3.7 洋甘菊残渣抑菌有效部位对金黄色葡萄菌抑制的测定

1.3.7.1 生长曲线测定

参考朱艳蕾[13]的方法，稍作改动。以灭菌液体培养基加浓度为1/2 MIC和MIC的乙酸乙酯相提取物作为试验组，灭菌液体培养基加金黄色葡萄球菌作为对照组。接入适量的金黄色葡萄球菌菌悬液，37℃、120r/min条件下，连续培养24 h，每隔2 h取一次样，测定不同时间下菌液的吸光值。为避免待测溶液自身颜色的干扰，以同浓度下的待测溶液作为调零对照。每组试验重复3次，取平均值。最后一同比浊测定其600 nm波长处的吸光值。

1.3.7.2 电导率测定

参考Sun等[14]的方法，稍作改动。试验组和对照组同上1.3.7.1。接入适量的金黄色葡萄球菌菌悬液，37℃、120 r/min条件下，连续培养24 h，每隔2 h取一次样。取适量菌悬液，4 000 r/min离心10 min，取上清液，测定其电导率。为避免待测溶液自身颜色的干扰，一同浓度下的待测溶液作为调零对照。每组试验重复3次，取平均值。

1.3.7.3 细胞壁完整性测定

参考薛梦莹[15]的方法，稍作改动。试验组和对照组同上1.3.7.1。接入适量的金黄色葡萄球菌菌悬液，37℃、120 r/min 条件下，连续培养 24 h，于培养 0、6、12、18、24 h分别取样，取适量菌悬液，4 000 r/min离心10 min，取上清液，参照试剂盒上说明书测定各个时间上清液中碱性磷酸酶含量。每组试验重复3次，取平均值。

1.3.7.4 胞外多糖含量测定

1）多糖标曲的绘制

参考张彦丽等[16]的方法，稍作改动。称取干燥至恒重的葡萄糖约20 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为200 μg/mL的对照品溶液。用移液枪准确量取葡萄糖对照品溶液0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL 分别置于15 mL干燥试管中，加水至10 mL，再分别加0.50 mL 6%苯酚溶液，在冷水浴中迅速加硫酸2.5 mL，摇匀即可。同时做一空白，按紫外分光光度法于490 nm处测定吸光值。

2）菌液胞外多糖的测定

参考Zhang等[17]的方法，稍作改动。试验组和对照组同上1.3.7.1。接入适量的金黄色葡萄球菌菌悬液，37℃、120 r/min条件下，连续培养24 h，每隔2 h取一次样，取适量菌悬液，4 000 r/min离心10 min，取上清液，测定其吸光值。为避免待测溶液自身颜色的干扰，以同浓度下的待测溶液作为调零对照。每组试验重复3次，取平均值。

1.3.7.5 胞外蛋白含量测定

1）蛋白标曲的绘制

参考Vaara[18]的方法，略做改动。以0.15 mol/mL的氯化钠水溶液为溶剂，精密配制1 mg/mL的牛血清蛋白标准溶液，备用。从中分别精密吸取0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL置于6支具塞刻度试管中，添加0.15mol/mL的氯化钠水溶液至终体积为0.10mL，后加入考马斯亮蓝G-250染液5mL，室温静置15min，利用紫外-可见光分光光度计测定不同浓度标准液吸光值，检测波长为595nm。每组试验重复3次，取平均值。

2）菌液胞外蛋白的测定

参考Vaara[18]的方法，略做改动。试验组和对照组同上1.3.7.1。接入适量的金黄色葡萄球菌菌悬液，37℃、120 r/min条件下，连续培养24h，每隔2h取一次样，取适量菌悬液，4000r/min离心10min，取上清液，测定其吸光度。为避免待测溶液自身颜色的干扰，以同浓度下的待测溶液作为调零对照。每组试验重复3次，取平均值。

1.4 数据处理

采用Excel 2010进行基础数据整理，采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，作图采用Origin 8.5绘图软件。

2 结果与讨论

2.1 洋甘菊残渣各极性部位中化合物的鉴定及含量测定

洋甘菊残渣各极性部位中化合物的鉴定结果见表1。

表1 洋甘菊残渣各极性部位中化合物的鉴定结果Table 1 Identification of compounds in polar parts of chamomile residue

由表1可知，水相中含有酚酸类化合物、多糖、黄酮类化合物，洋甘菊残渣各极性部位都含有黄酮类化合物。

洋甘菊残渣不同极性部位中酚酸、多糖、黄酮类化合物的含量结果如表2所示。

表2 不同极性部位中酚酸、多糖、黄酮类化合物的含量Table 2 Content of phenolic acids，polysaccharides，and flavonoids in different polar parts

由表2可知，不同极性部位中酚酸类化合物和多糖存在水相中；各相萃取物中均含有黄酮类化合物，其含量由大到小：乙酸乙酯萃取物＞二氯甲烷萃取物＞正丁醇萃取物＞石油醚萃取物＞水相。

2.2 抑菌活性检测结果

2.2.1 最小抑菌浓度测定结果

最小抑菌浓度可作为评价体外抑菌物质抑菌活性强弱的指标，其值越小，说明样品对菌的抑制效果越好。洋甘菊残渣分极萃取后对于各菌种的最小抑菌浓度如表3所示。

表3 残渣分极萃取后对于各菌种的最小抑菌浓度Table 3 MIC of the residue for each bacterial species after separate extraction of the residue

如表3所示，综合比较，洋甘菊残渣乙酸乙酯、正丁醇萃取物对4种供试菌的抑菌效果更好，其中乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，MIC为15.63mg/mL；其次为枯草芽孢杆菌，MIC为31.25mg/mL；而二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物对铜绿假单胞菌抑菌效果较好，MIC均为62.50 mg/mL；正丁醇和乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌具有较好的抑菌效果，MIC为250.00 mg/mL；石油醚相和二氯甲烷相并不能很好地抑制大肠杆菌的生长。

2.2.2 抑菌圈测定结果

在相同浓度下，洋甘菊残渣的4种溶剂萃取物对4种供试菌种均有一定的抑制作用，不同极性萃取物对4种供试菌的抑菌效果存在明显差异。洋甘菊残渣分极萃取后对于各菌种的抑菌圈大小如表4所示。

表4 残渣分极萃取后对于各菌种的抑菌圈大小Table 4 Size of the inhibition zone for each strain after separate extraction of the residue

由表4可知，乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌活性均为最佳。体外抑菌试验结果表明，洋甘菊残渣4种溶剂萃取物对革兰氏阳性菌的抑菌效果强于革兰氏阴性菌，由于革兰氏阴性菌的细胞壁由外膜和周质间隙组成，外膜由脂多糖、磷脂、蛋白质和脂蛋白等复合构成，周质间隙是一层薄的肽聚糖。外膜的存在构成了不对称的膜结构，因此形成对亲水性及疏水性物质的渗透屏[19]，影响了抑菌效果。综合MIC和抑菌圈的结果，发现乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用最佳，其最小抑菌浓度为15.63 mg/mL，同时抑菌圈直径也显示出比较高的抑菌活性。

2.3 洋甘菊残渣抑菌有效部位对金黄色葡萄球菌抑制的测定结果

2.3.1 生长曲线测定结果

乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响如图1所示。

图1 乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响Fig.1 Effect of ethyl acetate extract on the growth curve of Staphylococcus aureus

由图1可知，前6 h内，对照组金黄色葡萄球菌生长缓慢，属于菌落生长迟缓期，在6 h～16 h期间，细菌生长较快，属于菌落生长对数期；在16 h后，金黄色葡萄球菌生长速度较缓慢，菌落进入稳定区；对照组菌落生长长势较好，不同时期菌落特征明显，与试验组形成明显对比。1/2MIC和MIC乙酸乙酯萃取物处理的菌落生长趋势缓慢，从16 h开始，菌落生长速度增快。以上研究表明，洋甘菊残渣乙酸乙酯相萃取物对金黄色葡萄球菌的生长有抑制作用。

2.3.2 电导率测定结果

细菌菌体的电导率变化可直观地反映细胞膜通透性的变化规律，根据培养基电导率的变化状况，可以推测培养基中的微生物种类和数量[20]。乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌作用后的电导率如图2所示。

图2 乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌作用后的电导率Fig.2 Conductivity of ethyl acetate extract against Staphylococcus aureus

由图2可知，金黄色葡萄球菌培养2 h后，试验组菌体培养液的电导率明显升高，且试验组电导率高于对照组，MIC组高于1/2MIC组。说明洋甘菊残渣乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性有一定的改变，试验组的电导率高于对照组，可能是由于试验组释放到胞外的离子较多，导致溶液中离子含量增多。

2.3.3 细胞壁完整性测定结果

碱性磷酸酶（AKP）大多存在于细胞壁与细胞膜间。当细胞结构受到破坏，AKP由胞内渗出。因此，可通过检测AKP的活力来判断其对菌体细胞壁的破坏情况[21]。乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌作用后的胞外AKP变化如图3所示。

图3 乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌碱性磷酸酶的影响Fig.3 Effect of ethyl acetate extract on the alkaline phosphatase of Staphylococcus aureus

由图3可知，对照组和1/2MIC组的胞外AKP含量随着时间的推移增长缓慢。而MIC组，其胞外AKP的含量随时间的增长呈明显上升趋势，且在各时间点远大于对照组的AKP含量。在6 h～12 h时，胞外AKP含量迅速增加，说明此时细胞壁已经受到了损伤。对照组在试验的期间内，AKP含量基本不变；从12 h开始，添加了乙酸乙酯萃取物的1/2MIC组，其胞外AKP含量开始升高。洋甘菊残渣经乙酸乙酯提取后，试验组细菌胞外碱性磷酸酶活力较对照组明显增大，且MIC组高于1/2MIC组，说明洋甘菊乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌的细胞壁有一定的破坏作用，从而导致胞外碱性磷酸酶活力增加。

2.3.4 胞外多糖测定结果

多糖的拟合方程为y=4.994 3x+0.003 3，R2=0.999 0。乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌作用后的胞外多糖含量的变化如图4所示。

图4 乙酸乙酯相对金黄色葡萄球菌作用后胞外多糖的含量变化Fig.4 Changes in the content of extracellular polysaccharides after the action of ethyl acetate on Staphylococcus aureus

由图4看出，对照组在16 h后，胞外多糖含量基本不变，维持在0.185 mg/mL；MIC组4 h～16 h胞内多糖含量持续上升，16 h后缓慢上升，24 h达到最大值，为0.582 mg/mL，试验组的胞外多糖含量明显上升。可见洋甘菊残渣乙酸乙酯相提取物对金黄色葡萄球菌的细胞膜有一定的破坏性，并且随着样品浓度增大，胞外多糖含量变多，说明对细胞膜的破坏性越强。

2.3.5 胞外蛋白测定结果

胞外蛋白的拟合方程为y=2.510 3x+0.048 2，R2=0.997 2。乙酸乙酯相对金黄色葡萄球菌作用后的胞外蛋白含量的变化如图5所示。

图5 乙酸乙酯相对金黄色葡萄球菌作用后胞外蛋白的含量变化Fig.5 Changes in the content of extracellular protein after the action of ethyl acetate on Staphylococcus aureus

由图5看出，随着金黄色葡萄球菌培养时间的延长，洋甘菊残渣乙酸乙酯萃取物试验组细菌胞外蛋白质含量明显升高，而对照组细菌胞外蛋白质含量的变化较小。洋甘菊残渣乙酸乙酯相萃取物处理12 h后，MIC处理组的胞外蛋白质含量明显高于1/2MIC处理组和对照组；在反应时长为20 h，MIC处理组是1/2MIC处理组的0.64倍，处理效果极显著；在反应时长为22 h，MIC处理组是对照组的6.87倍，处理效果极显著；在反应时长为22 h，1/2MIC处理组是对照组的3.93倍，处理效果极显著。这可能是由于洋甘菊残渣乙酸乙酯相提取物使得金黄色葡萄球菌的细胞膜受到严重破坏，从而导致胞内蛋白质外溢。

3 结论

通过探究抑菌作用及抑菌机理的研究，发现洋甘菊醇提物经分极萃取后的各相的确有抑菌的作用。经分级萃取后对本试验选取4种菌种均有一定的抑制作用，其中乙酸乙酯相抑菌效果最佳，对金黄色葡萄球菌的MIC可达到15.63 mg/mL，抑菌圈直径可达19.73 mm。通过对金黄色葡萄球菌的抑菌机理探究发现，德国洋甘菊醇提物乙酸乙酯相试验组对抑制金黄色葡萄球菌的生长有所抑制；菌体的电导率随时间的变化也有所改变；试验组的胞外多糖、蛋白含量增加；由各试验指标结果可看出，MIC组对金黄色葡萄球菌的细胞壁完整性破坏较明显，通过测定胞外物质含量，发现细胞膜受到损坏，有改变细胞膜的通透性作用，最终达到抑菌的效果。

经鉴定多糖、酚酸由于极性较大，且含量较少仅在水相中被测出；在极性较小的萃取相中，多糖和酚酸存在可能性较低。黄酮类化合物的极性较小且易溶于醇，乙酸乙酯萃取相中含量最高，试验证明洋甘菊残渣中富含黄酮类化合物。经测定得出洋甘菊残渣不同极性部位中，乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果最好。通过对抑菌作用及抑菌机制的研究，发现洋甘菊残渣提取物有抑菌较好的抑菌效果，通过分极萃取后的乙酸乙酯相抑菌效果最佳；通过对金黄色葡萄球菌的抑菌机制探究发现，洋甘菊残渣乙酸乙酯相提取物抑制金黄色葡萄球菌的生长，使细胞膜受到损坏，提高导电率，从而使胞外多糖、蛋白含量增加。

探究抑菌作用及抑菌机制，进一步对其化学成分进行分析鉴定，确定活性物质基础，以明确新疆产的德国洋甘菊残渣作为天然抑菌剂、防腐剂的潜在应用价值，有效扩充了菊科植物化学成分数据库，为洋甘菊的质量控制和合理应用提供科学依据，促进新疆地区菊科资源的深度开发与高值化利用。