不同发酵原料对太和毛霉豆豉的品质及风味物质的研究

何维，刘迎涛，余玲，廖柯，安天星，赵志峰

(1.成都太和坊酿造有限公司，成都 610501；2.四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065)

豆豉起源于中国，在古代称为“幽寂”，是一种以大豆或黑豆为原料，经选杂、浸泡、蒸煮、制曲、拌料、后发酵等工序制成的传统发酵类调味品[1]，因其具有极高的营养价值和较高的食用、药用价值，独特的风味而深受大众喜爱[2]。按照参与发酵的微生物种类可以分为毛霉型豆豉、曲霉型豆豉、细菌型豆豉、根酶型豆豉四大类[3]，其中以毛霉型豆豉最富有特色[4]。豆豉的发酵过程主要是利用接种的微生物分泌产生的蛋白酶、糖化酶、脂肪酶等分解大豆蛋白、脂肪、淀粉等大分子物质，产生多肽、氨基酸、寡糖、单糖等物质，这些风味前体物质在后期的发酵过程中发生一系列的生化反应，同时加入一些调味品形成具有一定色、香、味且营养丰富的豆豉[5]。豆豉不仅蛋白质、脂肪、碳水化合物含量丰富，还含有多种生物活性物质如大豆异黄酮、大豆多肽、豆豉纤溶酶等，对延缓衰老[6]、降血糖[7]、降血压[8]及抗氧化活性[9]有一定的积极作用。

豆豉在发酵成熟过程中发生着复杂的化学变化，主要包括碳水化合物、蛋白质和脂肪的降解，使其口感更加细腻绵软[10]。毛霉豆豉作为毛霉型豆豉的代表之一，因其独特的生产工艺，特别是多样性菌群结构以及长达1年的发酵周期，孕育出了太和豆豉独特的风味，其香气浓郁持久、色黑油润有光泽、细腻化渣、无味调和，一直深受消费者喜爱[11-12]。

本研究采用不同种类的豆子(黄豆、黑豆、豌豆)作为发酵原料，并以总状毛霉M-THF-03将其进行分别接种，通过测定不同发酵时期还原糖、总酸、氨基酸态氮、类黑精的含量，再通过气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)测定不同种类豆豉中风味物质含量的变化，旨在通过品质与风味分析比较，研制出一种生产周期短、产品品质和稳定性都有所提升的毛霉型豆豉，能够为今后毛霉型豆豉的后发酵工艺及风味分析提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种：总状毛霉M-THF-03，已保藏于中国典型培养物保藏中心。

黄豆：产地黑龙江省讷河市；黑豆：产地黑龙江省齐齐哈尔市；豌豆：产地云南省丽江市。

1.2 试剂、仪器与设备

硝酸银、氢氧化钠、甲醛、三氯乙酸、乳酸钠、葡萄糖等：均为分析纯，成都鸿盛达科技有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、麦麸培养基：成都鸿盛达科技有限公司。

试验仪器与设备见表1。

表1 主要仪器设备一览表Table 1 The main instruments and equipment

1.3 实验方法

1.3.1 不同菌种豆豉的制备

毛霉黄豆豉的制作:黄豆除杂→清洗→浸泡→常压蒸煮→冷却→接种→前发酵(25 ℃、72 h)→拌和(10%食盐、1%白酒)→入池后发酵(常温发酵时间200 d以上)→成品。

毛霉黑豆豉的制作：黑豆除杂→清洗→浸泡→常压蒸煮→冷却→接种→前发酵(25 ℃、72 h)→拌和(10%食盐、1%白酒)→入池后发酵(常温发酵时间200 d以上)→成品。

毛霉豌豆豉的制作：豌豆除杂→清洗→浸泡→常压蒸煮→冷却→接种→前发酵(25 ℃、72 h)→拌和(10%食盐、1%白酒)→入池后发酵(常温发酵时间200 d以上)→成品。

将上述制备好的豆豉每隔30 d取样测定其氨基酸态氮、总酸、还原糖含量以及风味物质含量。

1.3.2 理化指标的测定

1.3.2.1 豆豉中还原糖含量的测定[13]

以葡萄糖的含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，回归方程：y=0.500 2x-0.001，相关系数R2=0.999 6。采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定豉曲的还原糖含量。

1.3.2.2 豆豉中氨基酸态氮、总酸含量的测定

参照GB 5009.235-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》，采用甲醛法测定氨基酸态氮与总酸含量。

1.3.2.3 豆豉中香味物质的提取方法

香味物质采用顶空固相微萃取技术进行提取[14]，取不同发酵时期的豆豉样品5.0 g于20 mL的顶空瓶内，盖上瓶盖，置于60 ℃恒温水浴锅中平衡20 min，将固相微萃取装置的萃取头手动插入顶空瓶中，顶空吸附20 min后，直接将萃取头注入气相色谱仪进样口处在230 ℃条件下脱附5 min。

1.3.2.4 香味物质的分析鉴定方法

采用气相色谱-质谱分析法(GC-MS)对提取的香味物质进行分析[15]。

气相色谱(GC)条件：采用 DB-5MS 毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，用氦气作载气，流速为1.0 mL/min。升温程序：色谱柱起始柱温40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升到230 ℃，保持5 min。

质谱(MS)条件：采集方式：全扫描，采集质量范围 40～400 m/z；电离方式：电子轰击(EI)；发射能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；接口温度：230 ℃。

1.3.2.5 豆豉香味物质分析定量方法

采用面积归一化法定量，通过豆豉中各组分的峰面积与各组分峰面积总和的比值来表示，按下式计算各组分的相对含量：

式中：Ci为待测组分i的含量；Ai为待测组分i的峰面积；Si为各组分峰面积之和。

2 实验结果分析

2.1 不同原料发酵过程中理化指标的变化

由图1～图3可知，3种不同原料豆豉的还原糖含量在发酵过程中均呈现下降的趋势，主要是因为豆豉在后发酵过程中被分解为单糖而被微生物利用。发酵的酸度会直接影响微生物的生长代谢及其种类，对豆豉品质的好坏也有很大的影响[16]。3种豆豉在后发酵过程中总酸含量都呈现上升的趋势，这是由乳酸菌与耐盐厌氧菌的生长、有机酸的增加而引起的。在豆豉发酵成熟过程中，氨基酸态氮可以反映蛋白质的水解程度，其含量的高低是判断豆豉是否成熟的一个重要标准，同时氨基酸态氮是豆豉中起主要鲜味作用的一种物质[17]。豆豉在后发酵过程中氨基酸态氮含量显著上升，主要是因为毛霉菌种产生的酶活较高，代谢产生的有机酸对酶的活性抑制较少，黄豆豆豉的氨基酸态氮含量明显高于黑豆豆豉与豌豆豆豉，说明黄豆豆豉中的蛋白质水解程度更高，所产生的鲜味物质也较高，其营养物质更有利于人体吸收。

图1 毛霉黄豆豉在发酵中还原糖、总酸、氨基酸态氮的变化情况Fig.1 Changes of reducing sugar, total acid and amino nitrogenin Mucor soybean Douchi during fermentation

图2 毛霉黑豆豉在发酵中还原糖、总酸、氨基酸态氮的变化情况Fig.2 Changes of reducing sugar, total acid and amino nitrogen of Mucor black bean Douchi during fermentation

图3 毛霉豌豆豆豉在发酵中还原糖、总酸、氨基酸态氮的变化情况Fig.3 Changes of reducing sugar, total acid and amino nitrogen of Mucor pea Douchi during fermentation

不同豆豉风味物质离子图见图4。

图4 不同豆豉风味物质离子图Fig.4 Ion diagram of the flavor substances of different Douchi

不同豆豉风味物质含量对比见表2。

表2 不同豆豉风味物质含量对比Table 2 Comparison of flavor substances' content of different Douchi

续 表

续 表

图5 不同种类豆豉香味物质种数统计图 Fig.5 Statistical chart of the number of flavor substance types in different types of Douchi

图6 不同种类豆豉香味物质相对含量统计图Fig.6 Statistical chart of the relative content of flavor substances in different types of Douchi

由图5和图6可知，黄豆豆豉共检测出52种香味物质，其中烷烃类28种，占总相对含量的42.90%；酯类11种，占总相对含量的48.2%；醚类1种，占总相对含量的1.06%；酮类2种，占总相对含量的0.91%；醛类4种，占总相对含量的4.26%；酸类1种，占总相对含量的1.71%；醇类2种，占总相对含量的3.46%；其他类4种，占总相对含量的0.46%。

由图5和图6可知，黑豆豆豉共检测出56种香味物质，其中烷烃类25种，占总相对含量的27.68%；酯类16种，占总相对含量的53.4%；醚类1种，占总相对含量的2.54%；醛类4种，占总相对含量的6.38%；酸类1种，占总相对含量的3.92%；醇类2种，占总相对含量的4.52%；其他类8种，占总相对含量的1.71%。

由图5和图6可知，豌豆豆豉共检测出37种香味物质，其中烷烃类26种，占总相对含量的42.41%；酯类11种，占总相对含量的47.13%；醚类1种，占总相对含量的0.94%；酮类1种，占总相对含量的0.43%；醛类4种，占总相对含量的3.05%；酸类1种，占总相对含量的2.33%；醇类4种，占总相对含量的2.73%；其他类11种，占总相对含量的2.66%。

2.2 豆豉中主体香味物质分析

3种豆豉共有的香味物质种类为烷烃类、醇类、醚类、醛类、酸类、酯类，香味物质种类占比最高的均为酯类。为了进一步分析3种豆豉香味物质的差异，选取每种豆豉中检测到的香味物质相对含量≥1%的物质单独剔除进行分析，结果见表3。

表3 不同豆豉主体香味物质分析Table 3 Analysis of main flavor substances of different Douchi

由图7和图8可知，黄豆、黑豆、豌豆这3种豆豉主体香味物质种数均为6种，主体香味物质总相对含量分别为86.25%、84.27%、86.87%。

图7 不同种类豆豉主体香味物质种数分析Fig.7 Analysis of the number of main flavor substance types in different types of Douchi

图8 不同种类豆豉主体香味物质相对含量分析Fig.8 Analysis of the relative content of main flavor substances in different types of Douchi

经过不同原料的香味物质分析，发现豆豉中主体香味物质大致相同。

相同的主体香味物质：烃类香味物质中，含量较高的是月桂烯、右旋萜二烯；酯类香味物质中，含量较高的是正己酸乙酯、乙酸芳樟酯；醛类香味物质中，含量较高的是苯甲醛；酸类香味物质中，含量较高的是3-甲基-丁酸，它们含量接近但有细微的不同。

豆豉和黄豆豆豉中各种主体香味物质相近，含量略微不同。黑豆豆豉中各种主体香味物质的种类数、含量略高于另外两种豆豉。但对豆豉香味物质丰富起到积极作用的烷烃类物质远低于黄豆豆豉、豌豆豆豉。而且黑豆豆豉中酸类香味物质3-甲基-丁酸含量较高，这对豆豉优良的风味是有影响的。

3 结论

本研究发现，3种不同的豆豉在后发酵过程中，还原糖含量都呈现下降的趋势，这主要是由于在前发酵过程中毛霉所分泌的糖化酶的累积，使大分子的碳水化合物被分解为还原糖而被微生物利用，这与杨伊磊[18]的研究结果基本一致。3种不同的豆豉的总酸与氨基酸态氮含量都呈现上升的趋势，其主要原因是豆豉在后发酵过程中在蛋白水解酶的作用下将蛋白质与多肽进一步分解为游离氨基酸，而随着发酵的进一步进行,酶活力减弱,再加上部分游离氨基酸参与了美拉德反应,使得氨基酸态氮和游离氨基酸的含量增加幅度减弱,趋于平缓[19]。根据研究结果发现[20]，豆豉在后发酵过程中，由于其微生物产生的酶解产生的酶的降解作用，蛋白质降解为氨基酸，糖类降解为单糖。采用固相微萃取GC-MS对毛霉型黄豆豉、毛霉型黑豆豉、毛霉型豌豆豉的风味进行对比，结果表明，毛霉型黄豆豉总共检测出52种香味物质，毛霉型黑豆豉总共检测出56种香味物质，毛霉型豌豆豉总共检测出37种香味物质。3种豆豉共有的香味物质为烃类、醇类、醚类、醛类、酸类、酯类，香味物质种类占比最高的均为酯类。酯类是香精中用量较大的合成香料，具有香味清散逸快且远、容易感觉到的特点，3种豆豉中检测到了正己酸乙酯、乙酸芳樟酯、苯甲酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯等酯类物质，其中多数被确定为大豆发酵调味品的特征香味物质[21]。醇类是豆豉中重要的挥发性化合物，而3种豆豉总共检测出芳樟醇、环辛烷甲醇等醇类，研究发现，在腐乳与豆酱的大豆发酵调味品中检出，并有被确认为大豆发酵调味品的特征香味物质[22-23]。总之，无论是从风味成分形成的数量还是含量看，后发酵是豆豉风味物质形成的主要阶段。由于豆豉风味的形成是微生物代谢及食物组分相互作用的结果，其各风味物质形成的机理还需进一步探讨。