牛布鲁氏菌抗体荧光快速检测试纸卡的研制

王英超，赵荣茂，张慧莹，刘海莹，高晓龙，高敏，郑博君，周德刚，梅力，冯小宇

（1.北京市动物疫病预防控制中心，北京 102629；2.北京纳百生物科技有限公司，北京 100176）

布鲁氏菌病（brucellosis，以下简称布病）是由布鲁氏菌（Brucella）感染引起的一种人兽共患传染病[1]。近年来，随着我国畜牧业的蓬勃发展，家畜饲养规模及数量不断增加，布病在人畜间的新发病例数量也随之急剧增加，布病防控形势严峻。同时，布鲁氏菌在小动物中的传播被认为是公共卫生领域的潜在风险，且可能成为新型生物战剂，严重危害国家安全和人民健康[2-3]。因此，需要加强畜间布病防控和净化，保障畜牧业健康发展及人民群众生命财产安全[4]。

目前，布鲁氏菌抗体的检测方法主要有凝集试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验以及荧光偏振测定法、胶体金免疫层析技术等[1]。凝集试验、补体结合试验是较为传统的检测方法，其操作较为复杂，灵敏度低，通常需要由专业人员操作；酶联免疫吸附试验、荧光偏振测定法，在操作方法和灵敏度上有一定的改善，但仍然需要配备专用仪器进行操作，无法实现现场实时检测；胶体金免疫层析技术因具有操作简单、检测快速、结果易判读、成本低等优点而得到广泛应用，但仍需进一步改善其灵敏度低、样本差异大等不足。因此，亟需研制一种简易、快捷、灵敏度高、稳定性好的布鲁氏菌抗体快速检测试剂，为布病免疫效果监控及净化提供技术支持，这对布病防控和净化具有重要意义[5-6]。

本研究采用间接荧光免疫层析技术，以荧光微球为载体标记兔抗牛IgG，以布鲁氏菌脂多糖（LPS）抗原包被固相膜，研制出一种牛布鲁氏菌抗体荧光快速检测试纸卡，其操作简单快捷、灵敏度高、稳定性好，能有效进行布鲁氏菌抗体的现场实时检测。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

硝酸纤维素膜（MDI90），购自MDI 公司；荧光微球（200 nm），购自苏州为度生物技术有限公司；样品垫、吸水纸、聚氯乙烯底板（PVC 底板），购自上海金标生物科技有限公司；兔抗牛IgG、羊抗兔IgG，购自北京博奥龙免疫技术有限公司；2-吗啉乙磺酸（MES），购自TCI 公司；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），购自Aladdin 公司；牛血清白蛋白（BSA），购自上海西宝生物科技有限公司；甘氨酸（Gly），购自中国医药集团有限公司；牛布鲁氏菌抗体阳性血清国家标准品（阳性标准品）和LPS 抗原，由中国兽医药品监察所提供。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

HM3230 型三维滑膜喷金仪、HM3030 型滑膜仪，购自上海金标生物科技有限公司；BHG-9245A 型电热鼓风干燥箱，购自上海一恒科学仪器有限公司；V200 型荧光试纸条读取仪，购自苏州和迈精密仪器有限公司；TGL-6 型离心机，购自湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 兔抗牛IgG-荧光微球偶联物制备

1.3.1 封闭液和复溶液的初步筛选（1）微球活化：将1%荧光微球用标记缓冲液（50 mmol/L MES，pH 6.0）做20 倍稀释；用标记缓冲液分别配制0.1 mg/mL NHS 和EDC（现用现配）；将配制好的NHS 和EDC 各取5 μL，依次加入1 mL 荧光微球溶液中，快速混匀，室温混匀孵育20 min。（2）微球清洗：将活化后的微球12 000 r/min 离心20 min，弃上清；用1 mL 标记缓冲液重悬微球，重复2 次。微球与抗体偶联：取0.025 mg 抗体于离心管中，加入活化后的微球，快速混匀后，室温混匀孵育2 h。（3）封闭：用纯水分别配制10%的BSA 和Gly，备用；各取500 μL 标记抗体的荧光微球，分别加入5 μL 的10% BSA 和10% Gly，室温混匀孵育1 h。（4）分离及复溶：将封闭好的微球，分装为100 μL/ 管，12 000 r/min 离心20 min；弃上清，用100 μL 复溶液复溶。按照配方（表1）分别配制复溶液。

表1 不同缓存体系复溶液配方 单位：%

1.3.2 复溶液的优化 按照1.3.1 进行微球标记，封闭液选择10% Gly，按照配方（表2）分别配制复溶液。

表2 不同复溶液配方 单位：%

1.3.3 兔抗牛IgG 标记量的优化 按照1.3.1 进行微球标记，封闭液选择10% Gly，复溶液选择1.3.2 中C 组复溶液；在微球与抗体的偶联中，兔抗牛IgG 标记量分别选取0.050、0.025、0.005、0.001 mg/mL。

1.4 划膜条件优化

按照1.3 中的优化条件，制备兔抗牛IgG-荧光微球偶联物，进行荧光试纸条划膜条件优化。

1.4.1 包被质量浓度优化 将LPS 抗原分别以0.5、1.0、2.0 mg/mL 的质量浓度，用滑膜仪按1 μL/cm 的体积喷涂到硝酸纤维素膜的检测线（T线）位置；将羊抗兔IgG 分别以0.2、0.5、1.0 mg/mL的质量浓度，用滑膜仪按1 μL/cm 的体积喷涂到硝酸纤维素膜的质控线（C 线）位置。

1.4.2 包被缓存液优化 按照1.4.1 优化后包被质量浓度，分别选取0.01、0.20 mol/L 两种浓度进行包被缓冲液优化。

1.5 检测方法建立及评价

1.5.1 临界值确定 按照1.3 及1.4 优化后方法，制备试纸条，检测67 例阴性样品，根据检测结果确定试纸条的临界值。

1.5.2 灵敏度分析 将牛布鲁氏菌抗体阳性血清标准品分别稀释成50.0、25.0、12.5、6.3、3.1、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 IU/mL，采用本研究建立的方法进行检测，分析试纸条的灵敏度。

1.5.3 特异性分析 采用本研究建立的方法，分别检测牛布鲁氏菌抗体阳性血清、牛口蹄疫病毒O 型（FMDV-O）抗体阳性血清、牛口蹄疫病毒A型（FMDV-A）抗体阳性血清、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗体阳性血清、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）抗体阳性血清，考察试纸条的特异性。

1.5.4 临床样本检测 采用本研究建立牛布鲁氏菌抗体荧光快速检测试纸卡，检测来自养殖场和屠宰场的469 份临床样品，并与荧光偏振方法进行比较，对比分析试纸条检测临床样品的性能。

2 结果与分析

2.1 兔抗牛IgG-荧光微球偶联物制备

2.1.1 封闭液和复溶液初步筛选 根据阴阳性差异及爬膜状态，选择最佳封闭液及复溶液。结果（表3）显示：当使用10% BSA 为封闭液时，效果都较差；条件1 的阴阳性差异及爬膜状态均优于其他组，因此选择10% Gly 为封闭液；0.05 mol/L Tris体系复溶液较优，故选择A组复溶液为基础复溶液，并进一步优化。

表3 封闭液和复溶液的初步筛选检测结果

2.1.2 复溶液优化 根据阴阳性差异及爬膜状态，选择最佳复溶液。结果（表4）显示：复溶液中不宜加入BSA，否则会导致荧光信号变弱；也不宜加入Gly 和吐温-20，否则会导致一定的堆球现象；而C 组配方的阴阳性差异及爬膜状态均优于其他组。因此，选择C 组配方作为复溶液。

表4 复溶液的优化检测结果

2.1.3 兔抗牛IgG 标记量优化 根据荧光反应强度及阴阳性差异（S/N），选择最佳兔抗牛IgG 标记量。结果（表5）显示：随着抗体添加量增加，T 线荧光强度有一定的增加，但增加到0.005 mg/mL后，增加幅度减小。故选择兔抗牛IgG 标记量为0.005 mg/mL。

表5 兔抗牛IgG 标记量的优化检测结果

2.2 划膜条件优化

2.2.1 包被浓度优化 根据荧光强度T/C及阴阳性差异（ST/C/NT/C），选择最佳包被质量浓度。对T、C 线不同包被质量浓度进行对比。结果（表6）显示：随着T 线包被质量浓度增加，T 线荧光信号有一定的增强，故T 线选择2.0 mg/mL 进行包被；随着C 线包被质量浓度增加，C 线荧光信号也有一定的增加，而T/C逐渐降低，同时ST/C/NT/C也逐渐降低。故选择ST/C/NT/C最高的0.5 mg/mL 质量浓度进行包被。即确定T 线LPS 抗原包被质量浓度为2.0 mg/mL，C 线羊抗兔IgG 包被质量浓度为0.5 mg/mL。

表6 包被质量浓度的优化检测结果

2.2.2 包被缓存液优化 根据荧光强度T/C、阴阳性差异（ST/C/NT/C）及线条显色状态，选择最佳包被缓冲液。结果（表7）显示：T 线包被缓冲液增加盐离子浓度，包被效果较好；C 线包被缓冲液增加盐离子浓度，包被效果有聚线现象。考虑与对应原料的原缓冲离子强度有关，T 线包被缓冲液可选择0.02 mol/L PBS，C 线包被缓冲液可选择0.01 mol/L PBS。

表7 包被缓存液的优化检测结果

2.3 检测方法建立及评价

2.3.1 临界值确定 按照优化后方法，制备试纸条，检测67 例阴性样品，检测结果见表8。根据阴性样品T/C的平均值（6%）+3倍标准差（3×2%），确定该方法的阴阳性临界值为12%，即T/C＜12%判为阴性，≥12%判为阳性。

表8 阴性样本检测与分析结果

2.3.2 灵敏度分析 将牛布鲁氏菌抗体阳性血清标准品分别稀释成50.0、25.0、12.5、6.3、3.1、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 IU/mL，采用本研究建立的方法进行检测，分析试纸条的灵敏度，以T/C≥12%表示对应抗体浓度的检测结果为阳性。结果（表9）显示，该方法的灵敏度可达0.8 IU/mL。

表9 灵敏度分析检测结果

2.3.3 特异性分析 采用本研究建立的方法，分析试纸条的特异性，结果见表10、图1。可以看出，FMDV-O、FMDV-A、BVDV、IBRV 阳性血清的检测结果均为阴性，表明该方法与常见牛疫病病原抗体无交叉反应，具有良好的特异性。

图1 检测试纸卡特异性分析结果

表10 特异性分析检测数据 单位：%

2.3.4 临床样本检测 采用本研究建立方法，检测469 份具有荧光偏振背景的临床样本，比较两种方法的符合率。检测结果（表11）显示：本方法检出9 份牛布鲁氏菌抗体阳性血清，荧光偏振也检出9 份阳性，且样品编号完全一致，说明两种方法的符合率为100%。

表11 临床样本的检测结果 单位：份

3 讨论

布病是全球密切关注的人兽共患病，严重危害人类生命及财产安全。因此，建立简易、快捷、灵敏度高、特异性好，且适用于临床样品快速检测的方法意义重大。以胶体金标记物为基础的免疫层析技术，因其操作简单、检测快速、结果易判读、成本低等优点，已被广泛应用于各个领域，显示出巨大的发展潜力和广阔的应用前景[7]，但其仍存在灵敏度低、样本差异大等不足。荧光标记物，作为一种新型的荧光标记材料，通过将荧光材料包埋于有机聚合物中，对荧光信号进一步放大，从而显著提高了检测灵敏度。荧光免疫层析技术既具备胶体金免疫层析法操作便捷，可现场实时检测的优势，又兼顾了荧光持续稳定的特性，可较好地克服胶体金免疫层析法检测结果不稳定的缺点，具有灵敏度高、特异性强等优点[8-10]。

本研究采用间接荧光免疫层析技术，以荧光微球为载体，标记兔抗牛IgG，以LPS 抗原包被固相膜，研制牛布鲁氏菌抗体荧光快速检测试纸卡。通过单一变量分析法，对反应体系进行了优化。通过检测牛布鲁氏菌抗体阴性样品，确定所建立检测方法的临界值，并分别对其灵敏度、特异性进行了分析，结果发现本研究建立检测方法的灵敏度可达0.8 IU/mL，与牛FMDV-O、FMDV-A、BVDV、IBRV 等病原抗体均无交叉反应，特异性良好。利用建立的方法对469 份临床样品进行检测，发现其检测结果与荧光偏振检测结果符合率为100%。研究表明，本研究建立的方法灵敏度高，特异性好，适用于临床样品的快速检测。

本研究建立的这种新型布鲁氏菌抗体快速检测方法，其灵敏度高于传统ELISA 及荧光偏振检测法，对疫苗免疫效果评估及布病净化有一定意义。但对于牛布病的防控与净化，仍需建立能准确鉴別自然感染与疫苗免疫抗体的检测方法，并通过多种检测方法联用，构建完善的流行病学调查工具以及防控与净化检测系统，从而更好地保护人类生命及财产安全。