IBRV 重组gD 蛋白的真核表达与间接ELISA检测方法的建立

郭宇，杨波，兰德松，郁茵，杨冬梅，王旭红，云涛，牧仁，李雷斌，孙雨

（1.内蒙古自治区动物疫病预防控制中心，内蒙古呼和浩特 010051；2.鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心，内蒙古鄂尔多斯 017000；3.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110164；4.北京市密云区动物疫病预防控制中心，北京 101500；5.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；6.中国动物疫病预防控制中心，北京 102600）

牛传染性鼻气管炎（IBR）又称牛病毒性鼻气管炎（BVR）、坏死性鼻炎（NR）或红鼻病（RND），是由牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）引起牛的一种急性、热性传染病。病毒学上，将IBRV 命名为牛疱疹病毒1 型，归属于疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科水痘病毒属。IBR 临床上以呼吸困难、鼻漏，以及上呼吸道及气管黏膜水肿发炎、淋巴结肿大、消瘦、产乳量大幅度降低等为主要特征。IBR 的危害在于病毒侵入牛体后可潜伏在一定部位，导致持续性感染，延缓育肥牛群的生长和增重，降低产奶量甚至停乳，使怀孕动物流产[1-2]，因而给养殖业带来较大危害，给本病的控制与消灭带来不小困难。本研究旨在建立一种灵敏的IBRV 检测方法，以推动该病的净化、控制进程。

IBRV 基因组为线性双股DNA 分子。基因组分成特异长区（UL，106 kb）和短区（US，10 kb），其中短区被两个反向重复序列（IRS、TRS 各11 kb）包围，因此能够反转方向，使病毒DNA 具有两种异构体[3]。IBRV 基因组可编码约70 个蛋白质，其中有15 个非结构蛋白和33 个结构蛋白，蛋白结构和功能目前大部分已知。研究[4]表明，IBRV 的12个囊膜蛋白中有10 个是糖蛋白（gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL 和gM），还有2 个未进行糖基化修饰。其中gB、gC、gD 和gE 4 个主要糖蛋白已完成测序并已在哺乳动物中表达。病毒糖蛋白可以刺激机体产生具有中和活性的抗体，并在病毒感染细胞过程中发挥十分重要的作用[5-7]。gD 蛋白位于基因组的短特异区，是病毒的一个重要结构蛋白。gD 蛋白被认为是病毒粒子表面和病毒感染细胞的主要分子，参与病毒吸附、侵入细胞的过程，是病毒复制的必需蛋白。gD 蛋白能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，并使机体产生中和抗体来中和病毒。

为获得在Sf9 细胞中高效表达的IBRV gD 蛋白，本研究通过优化IBRV gD 密码子序列，瞬时转染Sf9 昆虫细胞，改进抗原制备纯化条件，使用昆虫杆状病毒表达系统制备出病毒的gD 抗原。以纯化的抗原为基础，成功建立了相关抗体检测方法。

1 材料和方法

1.1 主要材料

大肠杆菌感受态细胞（DH10Bac）、Sf9 昆虫细胞、IBRV gD pFastBacHTA 质粒，由中国动物疫病预防控制中心保存。

1.2 主要试剂

质粒小提试剂盒，购自Promega 公司；SF900昆虫细胞培养基，购自GIBCO 公司；CellfectinTMII Reagen 转染试剂、BCA 蛋白定量试剂盒，购自Thermo Fisher公司；Casein Tryptone、Yeast extract、酶标兔抗牛二抗、Ni-Berpharose FF 纯化试剂盒等，购自北京康为世纪公司。

1.3 转染质粒的设计与构建

利用TMHMM 跨膜区在线预测系统、SignalIP在线预测系统等生物信息学分析软件，分析并预测经典IBRV（GenBank 登录号AFH08294.1）gD 蛋白的跨膜区序列、疏水区序列和稀有密码子。优化目的序列密码子并使用化学合成方法合成IBRVgD核苷酸序列，构建重组IBRV gD-pFastBacHTA 质粒。使用DNAman 软件设计IBRVgD基因扩增引物gD-F 和gD-R。上述引物序列由生工生物工程股份有限公司合成。

表1 IBRV gD 基因引物与M13 通用引物序列信息

1.4 重组质粒PCR 扩增与鉴定

合成上游引物gD-F 及下游引物gD-R，对重组质粒进行PCR 扩增，PCR 扩增后对目的序列产物进行测序并鉴定。

1.5 重组穿梭质粒构建与蓝白斑筛选

将重组质粒以三线法的方式划线接种于LB平板，挑单克隆、摇菌，提取重组质粒IBRV gDpFastBacHTA，利用1.3 中构建的IBRVgD基因上、下游引物进行验证，将PCR 鉴定为阳性的质粒进行测序并鉴定。

1.6 包装重组杆粒病毒并传代

将生长状态良好的Sf9 昆虫细胞平铺于细胞六孔板中，待贴壁1～2 h 后，按照CellfectinTMII Reagen 转染试剂说明书进行转染；细胞培养96 h后，反复冻融收集上清，将其命名为第1 代病毒；从第2 代病毒开始，加入第1 代病毒液和Sf9 细胞培养基，覆盖细胞，1～2 h 后弃去上清，加入2 mL的SF900 II 型细胞培养基；病毒转染细胞培养72 h，传至第5 代后，反复冻融离心收集上清，分装于无菌管做好标记，置于-80 ℃保存备用。

1.7 目的抗原表达与鉴定

将构建的重组质粒转染入Sf9 细胞进行表达。使用PBS 对收集的细胞沉淀进行洗涤，并加入细胞裂解液，冰浴离心后收集上清，使用镍原料纯化试剂盒对抗原进行初步纯化；纯化后，利用SDSPAGE 进行电泳鉴定，同时使用BCA 蛋白定量试剂盒测定纯化的蛋白浓度。

1.8 重组蛋白Western-blot 鉴定

利用Western-blot 进一步鉴定目的蛋白表达情况。以Anti-6x HisTagAntibody 为一抗，室温孵育1.5 h，用TBST 洗涤3 次；以抗鼠二抗作为二抗，室温摇床孵育1 h，用TBST 洗涤3 次；加入DAB显色液，观察条带的相对分子质量大小、清晰度及有无非特异条带。

1.9 gD 抗体间接ELISA 检测方法研究

1.9.1 ELISA 检测方法建立 将制备纯化后的gD抗原，按照8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 μg/mL 的梯度稀释后，包被于96 孔酶标板中；将IBRV 标准抗体阳性血清及阴性血清分别按1:10、1:20、1:50、1:100、1:200 的稀释度稀释后加入包被好的酶标板中，按照棋盘滴定法验证抗原的最优包被浓度与血清稀释度。使用不同浓度稀释后的牛血清白蛋白（BSA）封闭ELISA 酶标板，并通过不同稀释浓度确定最优封闭浓度。酶标二抗的最佳稀释浓度与作用时间，使用棋盘滴定交叉方法验证。按照IBRV 标准抗体阳性样本与阴性样本的OD450计算P/N值，将P/N最大值对应的ELISA 检测条件作为gD 抗体间接ELISA 检测方法的最佳反应条件。

1.9.2 Cut-off临界值确定 为确定IBRV gD ELISA 抗体检测方法的临界值，使用经血清抗体中和试验鉴定的223 份临床阴性牛血清，通过本研究建立的IBRV gD ELISA 抗体检测方法进行检测，根据检测出相应血清抗体OD450值分析检测出的结果，计算血清抗体的平均OD450值（X）及对应的标准偏差值（SD）。Cut-off临界值按公式计算：Cut-off临界值=阴性牛血清平均OD450（X）+4SD。当OD450＞X＋4SD 判定为阳性，否则判定为阴性。

1.9.3 特异性检测 使用本研究建立的间接ELISA 方法，对牛病毒性腹泻病毒抗体阳性血清、牛A 型口蹄疫病毒抗体阳性血清、牛O 型口蹄疫病毒抗体阳性血清、牛结节性皮肤病病毒抗体阳性血清进行检测，根据检测的OD450，计算Cut-off临界值，以此判定建立的间接ELISA 检测方法与其他牛类病毒是否存在非特异性交叉反应。

1.9.4 敏感性检测 使用采购的IBRV 标准抗体阳性血清，对本研究建立的间接ELISA 检测方法进行敏感性验证。将IBRV 标准抗体阳性血清按1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512的比例进行倍比稀释后检测，根据检测的OD450计算结果，得出阳性临界值时的最大血清稀释度，并将结果同血清中和试验的中和效价结果进行比对。

1.9.5 重复性检测 使用上述完善的ELISA 方法，对10 份不同中和效价的临床阳性血清进行批内与批间重复性测试，每个阳性血清样本做5个重复，根据检测的OD450计算批内、批间变异系数（CV）。

1.9.6 临床血清样品测试 使用本研究建立的ELISA 抗体检测方法与血清中和试验，对农业农村部兽医诊断中心保存的480 份临床样本进行比对检测，并计算两种检测方法的总符合率（包括特异性符合率、敏感性符合率）。

2 结果与分析

2.1 gD-pFastBacHTA 重组质粒构建与鉴定

使用特异性引物进行PCR 扩增，结果得到了与预期大小一致的PCR 产物片段（305 bp，图1）。将PCR 扩增产物送测序公司进行测序发现，PCR 产物序列与目的基因序列相同（图2），表明IBRV gD-pFastBacHTA 重组质粒初步构建成功。

图1 gD 片段PCR 扩增鉴定结果

图2 Bacmid-IBRV-G 测序比对结果

2.2 重组转座子Bacmid-IBRV gD 的PCR 扩增

使用通用引物与目的序列特异性引物进行交叉PCR 鉴定，结果发现4 对交叉引物均扩增出清晰、明确的目的条带，由此证明除正确目的基因外，连接上的穿梭载体也是正确的，表明IBRV gDpFastBacHTA 重组质粒完全构建成功（图3）。

图3 Bacmid-IBRV gD 的PCR 扩增鉴定结果

2.3 Bacmid-IBRV gD 致细胞病变观察

对细胞进行转染接毒后，在显微镜下观察第3代次细胞。结果（图4）显示：阴性对照组的Sf9细胞生长正常，且在高营养培养基环境下出现部分叠加生长而导致的轻微聚堆现象；感染病毒组的Sf9 细胞发生了特异性细胞病变，出现了明显的增殖抑制、细胞外观变圆、细胞核变大、细胞分散间隙大、细胞质内出现黑色颗粒及杂质等特征。

图4 转染Bacmid-IBRV gD 细胞病变（40×）

2.4 不同代次杆状病毒目的基因检测

将第3～5 代重组杆状病毒感染的Sf9 细胞提取基因组后，使用杆状病毒的gD-F/gD-R 为上下游引物进行PCR 扩增，检测各代次病毒基因组有无突变等特殊情况。检测发现，每个代次的扩增片段均一致，且条带明确（305 bp），说明gD序列已成功进入杆状病毒表达系统，并持续稳定存在于各代次的细胞中（图5）。

图5 不同代次杆状病毒目的基因PCR 扩增鉴定结果

2.5 重组蛋白表达与Western Blot（WB）鉴定

纯化后的重组IBRV gD 蛋白经SDS-PAGE 电泳鉴定后，结果在大小约为40 kDa 位置处存在一清晰条带，且前后没有明显杂质，表明纯度非常高（图6）；进行WB 试验，结果在与染色胶图目的条带的相同位置出现了明显棕色印记（图7），说明重组IBRV gD 可溶性蛋白成功表达，并且具有较好的反应原性。

图6 重组IBRV gD 蛋白SDS-PAGE 鉴定结果

图7 重组IBRV gD 蛋白Western-blot 检测结果

2.6 IBRV gD 间接ELISA 检测方法的建立与优化

2.6.1 抗原包被浓度与样品稀释度优化 对抗原包被浓度与样品稀释度进行优化后发现，当抗原浓度为0.5 μg/mL、4℃条件下作用18 h，2.5%BSA、4 ℃条件下封闭24 h，一抗血清稀释度为1:20 倍时，反应45 min，计算得出的P/N值最大。当酶标二抗的稀释度为1:30 000、二抗37 ℃条件下反应45 min，底物反应10 min 条件下的P/N值最高（表2）。

表2 IBRV gD 间接ELISA 检测方法的建立与优化结果

2.6.2 阴阳性临界值（Cut-off值）确定 使用本研究建立的IBRV gD ELISA 抗体检测方法，对经血清抗体中和试验鉴定的223 份临床阴性牛血清进行检测，结果223 份阴性血清平均OD450值（）为0.118，SD 为0.061，Cut-off值为+4SD=0.362。

2.7 ELISA 检测方法各指标验证

2.7.1 特异性验证 使用建立的IBRV gD ELISA抗体检测方法，分别检测了牛结节性皮肤病病毒抗体阳性血清、牛O 型口蹄疫病毒抗体阳性血清、牛A 型口蹄疫病毒抗体阳性血清、牛病毒性腹泻病毒抗体阳性血清，检测到的OD450值分别为0.093、0.086、0.107、0.094，均小于Cut-off值0.362，表明重组IBRV gD 抗原对上述牛病毒的抗体阳性血清无任何非特异性交叉反应，证明本研究所建立的方法特异性较好。

2.7.2 敏感性验证 使用购自英国WOAH 参考实验室的IBRV 标准抗体阳性血清（血清中和效价为1:256），对建立的IBRV gD ELISA 抗体检测方法对进行验证。结果显示，建立的IBRV gD ELISA 检测方法在稀释度1:512 时仍为阳性，表明检测敏感性高于传统的血清中和试验方法。

2.7.3 重复性验证 使用建立的间接ELISA 检测方法，将10 份不同中和抗体效价的IBRV 抗体阳性血清分别在同批次板（批内）和不同批次（批间）的酶标板上进行重复性验证，结果批内、批间检测的重复性变异系数均小于10%，表明所建立的ELISA 检测重复性好、变异较小，抗原稳定性较高，可用于不同抗体效价样本不同批次的IBRV 抗体检测（表3）。

表3 间接ELISA 检测方法的重复性验证结果

2.7.4 临床血清样品测试 使用建立的间接ELISA 检测方法结合血清中和试验，对中国动物疫病预防控制中心（农业农村部兽医诊断中心）保存的480 份临床血清样品进行检测，结果发现两种方法的敏感性符合率为98.18%，特异性符合率为93.33%，总符合率为96.67%（表4）。

表4 临床血清样品的测试结果 单位：份

3 讨论

IBR 作为农业农村部规定的二类动物疫病，长久以来给养殖户以及养殖业发展都带来了不小的影响，其一旦发病，尚无有效的药物治疗方法。对于本病的防控，主要采取疫苗免疫、抗体与病原监测，配合种畜群净化等综合措施。检测IBR 疫苗免疫后的中和抗体是评价疫苗免疫效果的重要途径。WOAH《陆生动物诊断检测与疫苗手册》（Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals）11.11章有关于IBR的诊断方法，涉及病毒中和试验、病毒分离、电镜观察、常规PCR、间接免疫荧光抗体等，国内只有行标《牛传染性鼻气管炎诊断技术》（NY/T 575—2019）[8]。这些方法为我国现有疫情防控提供了技术支撑。

分子生物学检测方法相较于病毒分离、中和试验等检测方法，具有检测速度快，检测结果量化、准确的优点，但存在病毒血症期短、动物机体样本取样困难、临床检测中不利于大面积监测推广等问题。血清中和试验作为传统的经典检测技术，是检测IBRV 的金标准方法，但其检测周期长、检测成本高、操作繁琐、判据复杂，不适于检测大量样本。本研究选用昆虫表达系统表达gD 蛋白，保留了蛋白原有的糖基化、乙酰化、磷酸化位点。蛋白折叠、二硫键形成更接近于天然蛋白，且表达量高。在此基础上，建立的IBRV 抗体间接ELISA 方法具有诸多优势，其中试验材料获取途径简单，检测速度快、结果准确，对试验环境、设备及人员的要求较低，并且相较于血清抗体中和试验敏感性更高，特异性更强、准确性极佳，可以客观评价IBR 疫苗免疫动物后的抗体免疫保护水平，对临床样本可实现大批量检测，对基层样本可进行大批量筛查，从而可以加快IBR 防控净化进程[8-10]。

目前检测IBRV 抗体的ELISA 试剂盒大多依赖于国外品牌，成本较高，且进口周期长，给基层动物防疫检测工作带来了较大困难。本研究建立的IBRV gD 抗体间接ELISA 检测方法与传统的血清中和试验方法相比，符合率可达96.67%，在保证检测方法特异性的同时，检测敏感性比血清中和检测方法更有优势，临床阳性血清样品检出率也更高，所以检测性能更具优势，具有较好的市场应用前景。同时本研究所建立的方法适合临床样本的大批量检测，可以用于基层IBRV 疫苗免疫效果评价、疫情监测等工作，应用前景广阔。