基于JAK-STAT信号通路的溃结宁膏对HT-29细胞炎症模型的影响

陈凯，朱莹

湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是常见的胃肠道慢性炎症性疾病，近年来发病率逐年上升[1]，且呈现年轻化趋势，给患者生活质量造成严重影响。UC病情缠绵难愈，且易复发，肠道炎症状态日久有并发结直肠癌的风险。

现代医学认为，UC与遗传、机体免疫、肠道微生态等密切相关[1-2]，病理表现为局部炎性细胞浸润，黏膜糜烂，散在性溃疡。白细胞介素（IL）是由多种细胞产生并参与机体多种生理病理反应的细胞因子。研究表明，IL-13、IL-6分泌量与肠道炎症水平呈正相关，而抗炎因子IL-10与肠道炎症水平呈负相关[3-4]。凋亡作为一种细胞程序性死亡方式，能够加重肠道炎症，进一步诱导肠道上皮细胞凋亡，二者相互影响[5-7]。JAK-STAT信号通路与细胞增殖、凋亡、分化等密切相关，IL-13、IL-6等细胞因子均能通过JAK-STAT信号通路进行转导，从而调控下游靶基因表达，影响UC病情[8-9]。

课题组前期以三硝基苯磺酸（TNBS）诱导UC大鼠模型，采用溃结宁膏进行干预，发现其能降低IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α等细胞因子分泌[10]。基于此，本实验以脂多糖（LPS）诱导人结肠癌HT-29细胞炎症模型，采用溃结宁膏穴位敷贴血清进行干预，观察其对HT-29细胞炎症反应及凋亡的影响，从JAK-STAT信号通路探讨其作用机制，为溃结宁膏治疗UC提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物及细胞

6～8周龄SD雄性大鼠18只，体质量180～220 g，湖南斯莱克景达实验有限公司提供，饲养于湖南中医药大学第一附属医院动物房，本实验经湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会审批（ZYFY20190814-1）。HT-29细胞，中国科学院细胞库。

1.2 药物及试剂

溃结宁膏穴位敷贴（炮附子、细辛、丁香、芥子、延胡索、赤芍、生姜按1∶1∶1∶1∶1∶1∶2比例组成），湖南省中医院制备；柳氮磺吡啶（SASP）肠溶片，批号09190501，上海信谊。McCoy” s 5a培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素（双抗）、胰蛋白酶，批号分别为PM150710、164210-50、PB180120、PB180226，武汉普诺赛；TUNEL试剂盒，批号40306ES50，上海翊圣生物；mRNA反转录试剂盒，批号CW2569，北京康为世纪；Trizol，批号15596026，美国Thermo；信号传导与转录激活因子（STAT）3抗体，批号ab31370，英国Abcam；p-STAT3抗体，批号ab76315，英国Abcam；Janus激酶（JAK）2抗体，批号ab39636，英国Abcam；JAK1抗体，批号ab133666，英国Abcam；HRP标记山羊抗小鼠IgG，批号SA00001-1，美国Proteintech；HRP标记山羊抗兔IgG，批号SA00001-2，美国Proteintech；电泳缓冲液，批号AWB0083，长沙艾碧维；蛋白酶抑制剂，批号583794，北京金泰宏达；显影液，批号BW-61，上海佳信；CCK8试剂盒，批号C0009，上海碧云天；IL-6、IL-10、IL-13试剂盒，批号分别为CSB-E08008r、CSB-E08005r、CSB-E08006r，武汉华美生物工程有限公司。

1.3 主要仪器

摇床（型号TS-92，海门其林贝尔），恒温箱（型号DYY-6C，北京贝一），荧光显微镜（型号BA410T，厦门Motic），台式冷冻离心机（型号H1650R，湖南湘仪），荧光定量PCR仪（型号PIKOREAL96，美国Thermo），生物样品均质仪（型号BioPrep-24，杭州奥盛），电泳仪（型号DYY-6C，北京六一），电泳槽（型号DYCZ-24DN，北京六一），化学发光成像系统（型号ChemiScope6100，上海勤翔）。

2 实验方法

2.1 细胞培养及造模

HT-29细胞用McCoy” s 5a完全培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化制成细胞悬液，以1×105个/mL接种于6孔板中，置于培养箱中贴壁过夜，加入1 μg/mL LPS处理24 h建立炎症模型。ELISA检测细胞培养液IL-6、IL-13含量，高于对照组（不加LPS处理）表明造模成功。

2.2 含药血清制备

大鼠适应性饲养1周后随机分为空白组、穴位敷贴组和SASP组，每组6只。空白组予生理盐水灌胃，穴位敷贴组予生理盐水灌胃及溃结宁膏穴位敷贴，具体穴位及操作参考课题组前期研究[10]，1次/d，2 h/次，每次贴于一侧，左右交替，连续14 d。SASP组予10 mg/mL SASP灌胃，灌胃体积5 mL/kg。末次给药2 h后腹主动脉采血，室温静置2 h，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，吸取血清，灭菌、过滤后于-20 ℃贮存备用。

2.3 含药血清浓度筛选

将HT-29细胞按5×104个/mL接种至96孔板，每孔100 μL，置于培养箱培养过夜。将细胞分为空白组、模型组、5%空白血清组、10%空白血清组、15%空白血清组、5%溃结宁膏血清组、10%溃结宁膏血清组、15%溃结宁膏血清组，每组4个复孔，除空白组外，加入含1 μg/mL LPS的完全培养基处理24 h。弃去培养基，更换含相应浓度血清的完全培养基继续培养24 h。每孔加入CCK8试剂10 μL，培养箱中孵育2 h，以不含细胞、只加培养基孔作为空白对照，酶标仪450 nm波长检测各孔吸光度（OD值），计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验组OD值-空白对照OD值）÷（空白组OD值-空白对照OD值）×100%。

2.4 分组及干预

筛选出最佳含药血清浓度后，将细胞分为空白组、模型组、空白血清组、溃结宁膏血清组和SASP血清组，加入含1 μg/mL LPS的完全培养基处理24 h，更换相应浓度血清继续培养24 h。空白血清组和SASP含药血清组使用与溃结宁膏血清组相同浓度的血清进行干预，空白组和模型组均使用完全培养基进行培养。

2.5 CCK8法检测

将HT-29细胞按5×104个/mL接种至96孔板，每孔100 μL，按“2.4”项下方法处理，加入CCK8试剂孵育2 h，检测各孔OD值并计算细胞存活率。

2.6 TUNEL染色

在24孔板中制作细胞爬片，按“2.4”项下方法处理，细胞爬片用多聚甲醛进行固定，依次加入Proteinase K工作液、TdT酶反应液、Streptavidin-TRITC标记工作液，DAPI工作液染细胞核，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，计算细胞凋亡率（凋亡细胞数÷总细胞数×100%）。

2.7 ELISA检测

收集培养后的细胞上清液，按试剂盒说明书检测IL-6、IL-10、IL-13含量。

2.8 RT-PCR检测

收集HT-29细胞，使用Trizol、三氯甲烷、异丙醇提取细胞总RNA，紫光分光光度计测定RNA浓度和纯度。配制反转录反应体系，将RNA反转录为cDNA，PCR进行定量扩增，2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.9 Western blot检测

收集HT-29细胞，预冷RIPA裂解液裂解，BCA法测定蛋白浓度，配制10%分离胶和4.8%浓缩胶，样本煮沸备用。75 V电泳至溴酚蓝到达分离胶底部时停止电泳，200 mA转膜1.5 h，5%脱脂奶粉封闭90 min，加入JAK2一抗（1∶750）、STAT3一抗（1∶750）、p-STAT3一抗（1∶5 000）、JAK1一抗（1∶2 000）、β-actin一抗（1∶5 000），4 ℃孵育过夜。膜室温放置30 min，加入HRP标记山羊抗小鼠 IgG（1∶5 000）、HRP标记山羊抗兔IgG（1∶6 000），室温孵育60 min，ECL显色液显色曝光，凝胶成像系统成像，使用Image J软件进行分析，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）灰度值比值计算蛋白相对表达量。

3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。数据以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 溃结宁膏穴位敷贴血清浓度筛选

与空白组比较，模型组和各浓度血清组细胞存活率明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，5%、10%、15%空白血清组细胞存活率差异无统计学意义（P＞0.05），5%、10%、15%溃结宁膏血清组细胞存活率明显升高（P＜0.05）；与5%、15%溃结宁膏血清组比较，10%溃结宁膏血清组细胞存活率明显升高（P＜0.05）。见表2。因此用10%溃结宁膏血清进行后续实验。

表2 不同血清浓度的HT-29细胞存活率比较（，%）

表2 不同血清浓度的HT-29细胞存活率比较（，%）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与10%溃结宁膏血清组比较，&P＜0.05

细胞存活率100.00±7.50 50.94±3.73*54.72±5.44*60.43±3.75*57.34±4.38*70.33±1.84*#&84.39±5.71*#66.74±3.95*#&组别空白组模型组5%空白血清组10%空白血清组15%空白血清组5%溃结宁膏血清组10%溃结宁膏血清组15%溃结宁膏血清组n 4 4 4 4 4 4 4 4

4.2 溃结宁膏对HT-29细胞存活率的影响

与空白组比较，模型组和不同血清组细胞存活率明降低（P＜0.05）；与模型组和空白血清组比较，溃结宁膏血清组和SASP血清组细胞存活率明显升高（P＜0.05）。见表3。

表3 各组HT-29细胞存活率比较（，%）

表3 各组HT-29细胞存活率比较（，%）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与空白血清组比较，&P＜0.05

细胞存活率100.00±5.00 57.22±4.67*61.46±1.92*83.26±3.78*#&86.58±5.03*#&组别空白组模型组空白血清组溃结宁膏血清组SASP血清组n 4 4 4 4 4

4.3 溃结宁膏对HT-29细胞凋亡的影响

与空白组比较，模型组和空白血清组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与模型组和空白血清组比较，溃结宁膏血清组和SASP血清组细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。见图1、表4。

表4 各组HT-29细胞凋亡率比较（，%）

表4 各组HT-29细胞凋亡率比较（，%）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与空白血清组比较，&P＜0.05

组别空白组模型组空白血清组溃结宁膏血清组SASP血清组n 5 5 5 5 5细胞凋亡率3.68±0.46 11.28±1.51*9.49±1.72*4.29±0.56#&4.24±0.61#&

图1 各组HT-29细胞凋亡阳性表达（TUNEL染色，×200）

4.4 溃结宁膏对HT-29细胞上清液白细胞介素-6、白细胞介素-10、白细胞介素-13含量的影响

与空白组比较，模型组和空白血清组细胞上清液IL-6、IL-13含量明显增加，IL-10含量明显减少（P＜0.05）；与模型组和空白血清组比较，溃结宁膏血清组和SASP组细胞上清液IL-6、IL-13含量明显减少（P＜0.05），IL-10含量明显增加（P＜0.05）。见表5。

表5 各组HT-29细胞上清液IL-6、IL-10、IL-13含量比较（，pg/mL）

表5 各组HT-29细胞上清液IL-6、IL-10、IL-13含量比较（，pg/mL）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与空白血清组比较，&P＜0.05

组别空白组模型组空白血清组溃结宁膏血清组SASP血清组IL-13 20.72±1.64 39.41±4.36*36.39±5.10*25.17±2.97#&23.49±3.37#&n 5 5 5 5 5 IL-6 25.12±3.05 53.41±3.52*47.19±2.74*31.17±6.09#&29.49±4.18#&IL-10 36.49±7.63 20.40±2.63*22.80±2.93*33.49±5.99#&31.80±4.24#&

4.5 溃结宁膏对 HT-29 细胞 JAK1、JAK2、STAT3、STAT6基因表达的影响

与空白组比较，模型组和空白血清组细胞JAK1、JAK2、STAT3、STAT6基因表达明显升高（P＜0.05）；与模型组和空白血清组比较，溃结宁膏血清组和SASP血清组细胞JAK1、JAK2、STAT3、STAT6基因表达明显降低（P＜0.05）。SASP血清组和溃结宁膏血清组各指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表6。

表6 各组HT-29细胞JAK1、JAK2、STAT3、STAT6基因表达比较（）

表6 各组HT-29细胞JAK1、JAK2、STAT3、STAT6基因表达比较（）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与空白血清组比较，&P＜0.05

组别空白组模型组空白血清组溃结宁膏血清组SASP血清组STAT6 1.35±0.41 7.31±1.36*5.62±0.77*2.76±1.01#&2.50±0.86#&n 5 5 5 5 5 JAK1 1.07±0.15 4.00±0.72*3.47±0.28*1.82±0.51#&1.71±0.39#&JAK2 1.29±0.22 3.80±0.91*3.35±0.71*2.06±0.41#&1.81±0.41#&STAT3 1.01±0.20 3.80±0.51*3.27±0.42*1.76±0.52#&1.67±0.38#&

4.6 溃结宁膏对 HT-29细胞 JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组和不同血清组细胞JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组和空白血清组比较，溃结宁膏血清组和SASP血清组细胞JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达明显降低（P＜0.05）。见图2、表7。

表7 各组HT-29细胞JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达比较（）

表7 各组HT-29细胞JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达比较（）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与空白血清组比较，&P＜0.05

组别空白组模型组空白血清组溃结宁膏血清组SASP血清组p-STAT3 0.21±0.02 0.55±0.03*0.52±0.02*0.38±0.03*#&0.34±0.03*#&n 5 5 5 5 5 JAK1 0.21±0.02 0.70±0.03*0.59±0.07*#0.37±0.06*#&0.38±0.06*#&JAK2 0.20±0.01 0.71±0.03*0.64±0.08*0.44±0.04*#&0.36±0.04*#&STAT3 0.20±0.01 0.70±0.02*0.65±0.08*0.47±0.03*#&0.37±0.03*#&

图2 各组HT-29细胞JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白免疫印迹

5 讨论

UC属中医学“泄泻”“痢疾”等范畴，病变早期以湿热蕴结为主，病情缠绵难愈，久病损伤机体阳气，高龄患者常兼有不同程度阳虚表现[11]。脾为仓廪之官，主饮食与水液代谢，水液代谢失衡，液体不循肠道，故出现腹泻。脾为后天之本，肾为先天之本，后天阳气病久影响先天阳气，故脾肾阳气亏虚是UC常见病机。阳气虚弱，血液运行不畅，气血瘀阻，通则不痛，故出现腹部疼痛不适。中药穴位敷贴通过药物刺激机体经络穴位，使皮肤血管扩张，促进药物吸收入血，进而调节机体功能，对改善UC患者腹痛、腹泻等症状具有一定作用[12-13]。溃结宁膏由课题组负责人朱莹教授根据UC脾肾阳虚证病机研制，由炮附子、细辛、丁香、芥子、延胡索、赤芍、生姜组成，具有温脾补肾、活血化瘀之效。前期研究表明，溃结宁膏治疗脾肾阳虚型UC临床效果显著[14-15]。动物实验表明，溃结宁膏穴位敷贴能通过抑制结肠黏膜炎症反应，进而控制UC病情发展[10]。

IL-6最初被发现是作为调节IgG产生的B细胞刺激因子，可由巨噬细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞等一系列细胞产生，在先天免疫和适应性免疫中发挥多效性活性。IL-6作为重要的促炎因子，其表达量与UC严重程度呈正相关。采用IL-6拮抗剂托珠单抗进行治疗能够有效缓解UC患者症状体征，改善内镜评分[16-18]。IL-13在Th2免疫应答中发挥关键作用，被认为与肠道疾病有关[19]。IL-13由Th2细胞、自然杀伤T细胞、先天淋巴细胞和先天免疫细胞产生，有助于触发和维持慢性特发性肠道炎症。同时IL-13能促进UC肠道上皮细胞凋亡，破坏肠道黏膜屏障。IL-10具有广泛的抗炎作用，通过抑制炎症反应和促炎因子释放，从而参与机体炎症反应的多个阶段。研究表明，IL-10对维持肠道稳态、调节机体免疫平衡具有重要作用[3，20]。UC病变组织上皮细胞凋亡程度明显高于正常组织，上皮细胞凋亡导致肠道屏障破坏，肠道微生物紊乱，加重肠道炎症反应，加重UC病情[21-22]。JAK-STAT信号通路对调节IL-6、IL-13、IL-10等炎症因子传导及肠道黏膜细胞凋亡有重要作用，抑制JAK-STAT信号通路活性可有效降低UC炎症因子分泌及肠道细胞凋亡[23-25]。

HT-29细胞是研究UC病理或药理机制的常用细胞之一，可以模拟UC相关炎症及凋亡因子分泌，已被用于UC体外实验多年，其可靠性已得到验证[26-28]。本实验结果显示，造模后细胞上清液IL-6、IL-13含量增加，表明炎症模型制备成功。采用溃结宁膏穴位敷贴血清进行干预，能增加HT-29细胞存活率，抑制细胞凋亡及减少促炎因子分泌，增加抗炎因子分泌，从而发挥抗炎作用。进一步检测JAK-STAT信号通路相关基因和蛋白表达发现，溃结宁膏能够降低细胞JAK1、JAK2、STAT3、STAT6基因及JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达，提示其可能通过抑制JAK-STAT信号通路发挥治疗UC作用。

综上所述，溃结宁膏可能通过降低JAK-STAT信号通路活性抑制HT-29细胞炎症反应及凋亡。本课题组从体外UC炎症角度出发，为溃结宁膏穴位敷贴的临床应用及UC的治疗提供实验依据。