干扰素治疗前后慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞和中性粒细胞表面CD64表达变化观察

尚鹏程，许娇，钟晶，毕雷

成都市公共卫生临床医疗中心检验科，成都 610000

干扰素治疗慢性乙型肝炎（CHB，简称慢乙肝）较传统药物治疗有明显的优势，但仍有许多需要解决的问题，如缺少用于优势人群筛选、疗效评估以及预后评判的有效实验室指标等［1］。CD64（FcγRI）是一种免疫球蛋白Fc 受体的跨膜糖蛋白，可以高亲和力结合单体IgG 型抗体，在细菌感染以及类风湿关节炎病患者外周血中性粒细胞表面表达上调，作为细菌感染性疾病的诊断指标在临床已被广为使用［2-3］。近年研究［4-5］发现，在巨细胞病毒以及HBV等感染患者CD64 的表达与健康人群不同，但CHB患者外周血细胞表面CD64 表达量变化与干扰素治疗慢乙肝的疗效是否有关目前仍无文献报道。本研究通过比较干扰素治疗前后慢乙肝患者外周血不同亚群细胞表面CD64 表达量差异，分析干扰素治疗不同时间CHB 患者外周血淋巴细胞和中性粒细胞表面CD64 表达量与HBV-DNA、ALT、HBsAg 的相关性，为下一步探讨外周血淋巴细胞和中性粒细胞表面CD64 表达量是否能用于评估干扰素治疗效果提供参考资料。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2018年6月—2021年3月在成都市公共卫生临床医疗中心就诊的CHB 患者57 例，纳入标准：ALT＞2 ULN、HBV-DNA＜2×108IU/mL、HBsAg 定量＜25 000 IU/mL，且接受干扰素单独/联合/序贯治疗的CHB 患者。排除标准：伴有肝硬化、肝癌、自身免疫性肝病、肝功能失代偿、HCV/HIV 感染以及研究资料缺失。按e 抗原表达不同分为e 抗原阳性组33 例，男18 例、女15 例，年龄（28.5 ± 10.6）岁，ALT （156.9 ± 132.4）U/L、HBsAg （18 976.5 ± 16 981.7）IU/mL、HBV-DNA（6.8 ± 0.75）lgIU/mL；e 抗原阴性组24 例，男15 例、女9 例，年龄（34.1 ± 13.9）岁，ALT （106.3 ±100.5）U/L、HBsAg（15 643.9 ± 16 324.3）IU/mL、HBV-DNA （5.8 ± 1.5）lgIU/mL；两组间性别、年龄、ALT、HBsAg以及HBV-DNA差异均无统计学意义（P均＞0.05）。收集同期体检健康人员16例为对照组，男10 例、女6 例，年龄（34.7 ± 12.2）岁。三组年龄性别有可比性。

1.2 外周血淋巴细胞、中性粒细胞表面CD64 检测 CHB 患者在干扰素治疗前，治疗8 周、12 周、24周和48 周时，取晨起空腹EDTA-K2抗凝外周静脉血50 μL，依次加入试剂（CD3-FITC、CD64-PE、CD14-ECD、CD45-PECY5.5，购自贝克曼库尔特）各5 μL，混匀后避光孵育15 min，加300 μL 红细胞裂解液，避光作用15 min，加300 μL 生理盐水混匀后上贝克曼库尔特DxFlex 流式细胞仪检测。在SSC-CD45 图上设置中性粒细胞门和淋巴细胞门、在CD14-CD45图上设置单核细胞门，在CD64-CD45 图上分析上述三群细胞表面CD64表达量。

1.3 外周血ALT、HBsAg、HBeAg 和HBV-DNA 的检测 CHB 患者在干扰素治疗前、8 周、12 周、24 周和48 周时，分别检测ALT、HBsAg、HBeAg 和HBVDNA。其中，ALT 采用丙氨酸底物法，使用日立Cobas008As全自动生化分析仪及其配套试剂；HBsAg、HBeAg 采用化学发光法，使用万泰全自动化学发光分析仪CARIS200及其配套试剂；HBV-NDA 采用Rt-PCR 法，使用厦门安普利全自动核酸提纯及荧光PCR分析系统及其配套试剂。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.02 统计软件。正态性分析采用Shapiro-Wilk 检验，符合正态分布的计量资料用±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey 法；计数资料用频次或百分比表示，比较采用χ2检验。相关性采用Pearson 相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组干扰素治疗不同时间外周血淋巴细胞、中性粒细胞表面CD64 的表达量比较 干扰素治疗前，CHB 组外周血淋巴细胞表面CD64 和中性粒细胞表面CD64 表达量高于对照组，t值依次为3.318、3.149，P均＜0.05。e抗原阳性组、e抗原阴性组以及对照组间淋巴细胞表面CD64 表达量比较，F=3.413，P＜0.05，其中e 抗原阳性组与对照组，e 抗原阴性组与对照组间差异均有统计学意义（P均＜0.05）；而e 抗原阳性组与e 抗原阴性组间比较，P＞0.05。e 抗原阳性组、e 抗原阴性组以及对照组间中性粒细胞表面CD64 表达量比较，F=6.591，P均＜0.05，其中e抗原阳性组与对照组，e抗原阳性组与e抗原阴性组间比较，P均＜0.05；e抗原阴性组与对照组比较，P＞0.05。

与干扰素治疗前相比，淋巴细胞表面CD64 表达量在CHB 患者中逐渐降低且24 周和48 周水平差异具有统计学意义（t分别为1.532 0、0.979 9、3.717 0、10.500 0，P分别为0.146 3、0.346 5、0.002 1、＜0.000 1）；在e抗原阳性组（t分别为0.401 5、1.149 0、2.764 0、5.317 0，P分别为0.692 1、0.265 5、0.003 4、＜0.000 1）和e 抗原阴性组也存在同样趋势（t分别为0.755 1、0.796 6、1.411 0、13.260 0，P分别为0.334 1、0.470 3、0.231 1、0.000 2）。中性粒细胞表面CD64 表达量在CHB 组（t分别为0.423 1、1.101 0、1.498 0、5.321 0，P分别为0.653 2、0.224 5、0.148 7、＜0.000 1）、e抗原阳性组（t分别为0.826 1、1.152 0、1.939 0、5.072 0，P分别为0.421 7、0.271 8、0.071 6、0.000 2）和e抗原阴性组（t分别为0.280 5、0.242 6、0.474 6、1.922 0，P分别为0.793 0、0.820 3、0.659 8、0.127 0）中也呈现递减趋势，但仅在48 周时，CHB 组和e 抗原阳性组中差异有统计学意义。干扰素治疗不同时间各组淋巴细胞、中性粒细胞CD64表面表达量见表1。

表1 干扰素治疗不同时间各组淋巴细胞、中性粒细胞表面CD64表达量（±s）

表1 干扰素治疗不同时间各组淋巴细胞、中性粒细胞表面CD64表达量（±s）

组别CHB组淋巴细胞表面CD64中性粒细胞表面CD64治疗前治疗8周治疗12周治疗24周治疗48周e抗原阳性组912.73 ± 103.22 860.79 ± 101.88 874.92 ± 173.85 608.42 ± 293.79 272.65 ± 26.27 3 314.40 ± 945.73 3 480.55 ± 944.66 2 765.05 ± 851.52 2 547.48 ± 943.62 1 190.61 ± 306.75治疗前治疗8周治疗12周治疗24周治疗48周e抗原阴性组913.91 ± 116.78 834.12 ± 65.64 903.00 ± 197.79 556.16 ± 283.96 280.22 ± 29.48 3 443.73 ± 828.91 3 764.39 ± 617.03 2 809.42 ± 924.18 2 366.09 ± 891.47 1 247.29 ± 305.85治疗前治疗8周治疗12周治疗24周治疗48周对照组909.50 ± 65.14 940.79 ± 184.49 832.79 ± 191.65 721.98 ± 289.70 257.53 ± 12.56 814.80 ± 71.25 2 958.75 ± 985.94 2 629.05 ± 1 552.30 2 698.49 ± 1 085.07 3 635.81 ± 943.00 1 077.24 ± 388.94 2427.00 ± 742.70

2.2 CHB 患者外周血淋巴细胞、中性粒细胞表面CD64 表达量与ALT、HBV-DNA、HBsAg 水平的相关性 CHB 患者干扰素治疗前、治疗后8、12、24、48周外周血HBV-DNA、ALT、HBsAg 水平见表2。CHB 患者淋巴细胞表面CD64 表达量与外周血ALT 和HBsAg 水平存在正相关性（r分别为0.882 3、0.909 8，P均＜0.05）；中性粒细胞表面CD64表达量与外周血ALT和HBsAg水平亦存在正相关性（r分别为0.899 3、0.902 4，P均＜0.05）。

表2 CHB患者干扰素治疗前、治疗后8、12、24、48周外周血HBV-DNA、ALT、HBsAg水平（±s）

表2 CHB患者干扰素治疗前、治疗后8、12、24、48周外周血HBV-DNA、ALT、HBsAg水平（±s）

治疗时间治疗前治疗8周治疗12周治疗24周治疗48周ALT（U/L）147.2 ± 128.3 119.3 ± 96.8 79.3 ± 68.9 45.2 ± 36.2 16.9 ± 13.3 HBsAg（IU/mL）17827.1 ± 16 981.7 13875.4 ± 11 827.9 10004.5 ± 9 876.2 4293.6 ± 4 018.3 429.3 ± 365.3 HBV-DNA（lgIU/mL）6.5 ± 1.1 4.4 ± 1.3 3.3 ± 1.4 3.2 ± 1.3 2.5 ± 0.8

3 讨论

CHB 是HBV 感染慢性化后引起的以肝脏慢性炎症反应为特征的消化系统疾病，是引起肝硬化和肝细胞癌的重要原因。由于感染HBV 后肝细胞核内形成的共价闭合环状DNA（cccDNA）使得HBV 感染后难以完全根除。目前以核苷类似物和干扰素治疗为代表的抗病毒治疗可以实现长期抑制病毒甚至达到临床治愈的目标。干扰素治疗CHB 可以提高HBsAg 清除率和HBeAg 血清转换率。虽然HBsAg 定量用于指导干扰素治疗已写入多个指南，但在HBsAg 定量临床应用时仍有许多问题亟需解决，如预测停用核苷类药物HBsAg 血清清除的起始治疗时血清HBsAg 浓度和监测频率、预测HBsAg 清除1年后发生HBeAg 清除的HBsAg 浓度等。此外，在干扰素治疗CHB 优势患者的筛选和过程中治疗方式的调整以及治疗结束后患者远期疗效的判断等方面需要有更精确的检测指标。近年研究［6］发现，Fc-FcγR 相互作用在抗体介导的病毒清除中起关键作用，通过对该途径的进一步研究有助于发现病毒性感染疾病治疗的新策略。

CD64即FcγRI型，对IgGFc有高亲和性，可以促进树突状细胞抗原交叉提呈和T 细胞活化，介导体内的ADCC 以及有助于IgG 依赖的中和作用等。研究［7］发现，FcγRI可以触发各种过敏性和自身免疫性疾病的模型，如过敏反应、类风湿性关节炎或气道炎症。本研究发现，CHB 患者外周血淋巴细胞及中性粒细胞表面CD64 表达量上调，与FENG 等［8］报道结果一致，推测CHB患者在HBV特异抗体的介导下通过上调CD64 表达，启动天然和适应免疫的多种机制（抗体依赖的细胞介导的细胞毒性、补体溶解或吞噬作用），以清除HBV病毒。

通过分析HBeAg 表达不同CHB 患者外周血淋巴细胞表面CD64的表达量，发现e抗原阳性组、e抗原阴性组以及对照组间淋巴细胞表面CD64 的表达量存在统计学差异。接下来通过对三组间淋巴细胞表面CD64 表达量的比较，发现e 抗原阳性组与对照组，e 抗原阴性组与对照组间均存在统计学差异，e抗原阳性组患者外周血淋巴细胞表面CD64 表达量高于e抗原阴性组患者，推测e抗原阳性组患者免疫系统通过上调淋巴细胞表面CD64 表达，利用Fc-FcγR 轴触发对HBV 更强的免疫反应，能更有效地清除HBV 感染的靶细胞。而淋巴细胞表面CD64 表达量在e 抗原阳性组与e 抗原阴性组间的差异无统计学意义，可能与机体免疫反应较e 抗原的阴转延迟有关，也有可能与研究对象的数量较少有关。对e 抗原表达不同CHB 患者外周中性粒细胞表面CD64 表达量进行分析，也发现e 抗原阳性组的中性粒细胞表面CD64 高于e 抗原阴性组和对照组，提示e 抗原阳性组患者粒细胞CD64 表达上调，增强粒细胞及其产物分子诱导机体对乙肝病毒的适应性免疫应答，CD64 分子介导的机体对HBV 免疫应答的具体分子机制还有待进一步研究。

对干扰素治疗不同时间的淋巴细胞表面CD64和中性粒细胞表面CD64 表达量分析发现，随着疗程延长，淋巴细胞表面CD64 和中性粒细胞表面CD64 表达量都呈现出下降趋势，并且与HBsAg 和ALT 均相关，其中淋巴细胞、中性粒细胞表面CD64与HBsAg 的相关性与淋巴细胞、中性粒细胞表面CD64 与ALT 相当。另外，与干扰素治疗前比较，淋巴细胞表面CD64 表达量在干扰素治疗24 周时下降，中性粒细胞表面CD64 表达量在干扰素治疗48周时下降，提示淋巴细胞表面CD64 较中性粒细胞表面CD64 可能更适合用于干扰素疗效的评估，其具体应用价值还有待进一步研究。淋巴细胞、中性粒细胞表面CD64 与HBV-DNA 未发现有相关性，由于抗病毒治疗后HBV-DNA 在4 周时迅速下降而淋巴细胞、中性粒细胞表面CD64 则分别在24 周和48周时下降，提示病原学指标较免疫学指标变化快。

综上所述，CHB 患者外周血淋巴细胞和中性粒细胞表面CD64 表达量升高，干扰素治疗后淋巴细胞和中性粒细胞表面CD64 表达量下降；淋巴细胞和中性粒细胞表面CD64 表达量与HBsAg 和ALT 水平正相关。由于本研究纳入的研究对象数量较少，其结果对CHB 患者外周血细胞表面CD64 指导干扰素临床应用的价值有限，下一步将扩大样本量，观察干扰素治疗不同时间CHB 患者外周血淋巴细胞和中性粒细胞表面CD64 表达量，同时探讨CHB 患者外周血细胞表面CD64 表达量对干扰素治疗CHB 效果的评估效能。