从线粒体外膜转运蛋白70 研究“诸湿肿满,皆属于脾”与糖尿病心肌病的关系

何昱霖,林心君

(1.福建中医药大学 中西医结合研究院,福建 福州 350122;2.福建中医药大学 中西医结合学院,福建 福州 350122)

随着经济社会的发展和人口老龄化的加重,糖尿病患病率逐年增高,2020年流行病学调查显示,中国公民糖尿病患病率为12.8%[1]。糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy,DCM)是糖尿病常见的并发症之一,独立于原发性心肌病(如肥厚性心肌病、扩张性心肌病)和继发性心肌病(如高血压、冠心病),致死致残率高,主要诱导因素是糖尿病糖脂代谢失调[2]。心肌线粒体在心肌糖代谢功能中发挥重要作用,线粒体功能障碍在DCM发病中起关键作用[3]。线粒体外膜70转位酶(Tom70)主要功能为促进线粒体前体蛋白的导入,大量研究表明,通过Tom70抗氧化和抗凋亡特性可以改善DCM进程[4]。中医学理论认为,脾主运化,人体一切水液代谢、聚集、输布都与脾有关。《素问· 至真要大论》中“病机十九条”提到:“诸湿肿满,皆属于脾”,指脾主运化水谷和水液,脾气健运将水谷精微上输心肺,充养全身;若脾失健运和传输功能失常,导致痰饮水湿停聚而产生“诸湿肿满”的临床症状。脾之散精功能正常发挥,可以维持机体糖代谢的协调与平衡。通过临床与实验研究发现,中医脾虚证能够在消化系统和心血管系统表现出线粒体结构与功能的异常[5]。以线粒体外膜上的 Tom70为切入点探讨脾主运化与DCM发病关系,揭示“诸湿肿满,皆属于脾”与DCM发生发展的关系,为研究DCM病因病机和治疗提供新思路。

1 脾的中医生理功能与DCM之间的联系

1.1 脾主运化与DCM的关系

《素问·阴阳应象大论篇》云:“中央生湿,湿生土,土生甘,甘生脾…… 其在天为湿,在地为土,在体为肉,在藏为脾……”脾在阴阳学说中属阴土,五行学说中属中土,三焦理论中属中焦。生理功能是主运化,主统血,主升清。脾胃同居中焦,关系密切,共同构成核心的消化系统;脾胃协同转化水谷精微为血脂、血糖等营养物质为身体供能。《灵枢·营卫生会》中提到:“中焦泌糟粕,蒸津液,受气取汁,变化而赤是为血。”若脾胃和则升清降浊功能正常,则水谷精微可以“奉心化赤”,通过心、肺化生气血参与体循环,濡养全身。脾的生理特性为喜燥恶湿,湿邪最易伤及脾阳,脾阳不足会内生湿邪,外界湿邪加重内湿,困厄脾阳,脾病不能为胃行其津液,不得秉水谷气,郁积形成痰湿、瘀血。痰湿和瘀血郁而化热,闭阻心气和脉道成瘀。

中医学认为,DCM根据其症状和体征,可以归为“消渴”“胸痹”“惊悸”和“怔忡”范畴;明代戴思恭《证治要诀》中记载:“消心之病,往往因欲饮食过多,及食啖辛热,饮引既多,小便亦多。”[6]DCM临床症状与“消心”基本一致。《医宗必读·痰》云:“脾土虚湿,清气难升,浊气难降,留中滞膈,瘀而成痰。”脾阳不足,难以运化水液,气不化津而聚之生“诸湿肿满”,水湿停留则浮肿,津液不布则口干,痰浊阻遏致心慌胸闷,胸阳不振加重痰瘀内阻心脉[7]。糖脂代谢过程中微血管晚期糖基化终末产物(AGEs)沉积、炎症因子、细胞外基质(ECM)累积都属于“痰浊和瘀血”累积在心肌细胞中;糖脂代谢紊乱、氧化应激和炎症反应引起心肌功能和心血管功能障碍就属于“痰瘀内阻心脉”。

1.2 脾主运化与线粒体的关系

线粒体是身体的能量工厂,其通过三羧酸循环氧化磷酸化让摄入身体的糖、脂肪和蛋白质(水谷精微物质)转化为ATP提供能量(精、气、神);其中关键环节琥珀酸单酰Co-A 与甘氨酸相结合生成血红素(即气能生血)[5]。线粒体存在于除红细胞以外所有组织细胞中,且线粒体mtDNA疾病会影响所有组织器官产生不同的疾病[8]。《脾胃论·脾胃盛衰论》云:“百病皆脾胃衰而生也。”体现出脾胃与线粒体功能相似,皆为气血生化之源,精、气、神产生之原动力。

心肌能量的来源主要为线粒体呼吸链氧化磷酸化的反应,心肌细胞线粒体的功能和结构直接影响心功能。研究表明脾气虚时,心肌线粒体损伤导致ATP合成不足,造成线粒体发生DNA突变和缺失,导致呼吸链酶复合物活性下降和线粒体产能减少导致心肌收缩功能障碍[9-10]。同时,有学者研究发现,脾失运化与痰瘀互结会导致心肌线粒体膜通透性下降,释放出过多的细胞内活性氧(ROS)与其细胞色素C(Cyt-c),引发细胞凋亡导致心脏收缩能力和舒张能力降低,泵血功能异常[11]。ROS来源于线粒体,通过健脾化浊法可减少心肌线粒体氧化应激产生,从而改善血管内皮损伤来缓解DCM。裴宇鹏等[12]通过运用健脾化痰祛瘀方激活心肌线粒体自噬来维持心肌细胞内环境稳态。所以,线粒体为心肌供能的功能与中医的“脾”有共同之处;而脾为心之子,脾病可及心,脾与心肌线粒体更是有密不可分的联系。

1.3 脾失运化-线粒体功能障碍导致DCM发生

DCM的发病机制尚未完全明确,代谢紊乱、心肌细胞自噬、心肌纤维化、心肌细胞凋亡、微血管病变、氧化应激、内质网应激、炎症反应、脂肪毒性和线粒体结构功能改变等因素都参与DCM发生发展过程[13-14]。线粒体损伤在DCM发病时可引起线粒体能量代谢障碍、线粒体氧化应激增强、线粒体分裂与融合紊乱、心磷脂变化以及Ca2+紊乱等发生,进一步导致心肌舒缩功能障碍、冠状动脉微血管病变和心脏结构发生改变[15]。有学者通过线粒体有丝分裂吞噬作为DCM治疗靶点,通过线粒体移植、服用抗氧化剂和生物燃料来对抗活性氧不足引起的DCM[16]。

中医基础理论中的“脾”涵盖了“脾系脏器”,“脾系脏器”除中焦之脾胃,还包括胰腺、肝脏和大小肠。营养物质通过胃肠道吸收后进入肠系膜静脉再进入门静脉,在肝脏内转化为人体所需营养物质进入心脏,进而供应全身脏器。当脾主运化功能出现异常时,脂膏传输功能失常,湿热痰浊、毒邪郁结、血脉寒凝血瘀便产生,阻塞于心脉。有研究证明,高脂引起的冠状动脉粥样硬化(AS)主要由于脂质沉积动脉内皮(毒邪郁结于血脉),引起慢性炎症,导致冠状动脉狭窄(寒凝血瘀内阻血脉),且与心肌线粒体呼吸功能失常密切相关[11]。樊一波等[17]选用归脾经补脾气的药物葛根为君药干预DCM模型大鼠心肌线粒体,损伤的线粒体膜电位和心肌ATP浓度都有所提高。以上研究可表明,脾失运化的功能失常从微观引起心肌线粒体功能受损,ROS产生从而引发心肌细胞凋亡,同时引发冠状动脉血管病变,导致心脏舒缩功能障碍诱发DCM;宏观上会引起水湿、痰浊和瘀血内生而出现各种湿病、浮肿和胀满以及口干、纳呆、便溏、舌苔白腻、齿痕重等临床特征。

2 Tom70参与调节DCM的机制研究

2.1 Tom70与DCM的关系

心肌组织中线粒体极为丰富,Tom70在线粒体外膜上分布较多,最早发现鉴定酿酒酵母中Tom70是1983年[18]。Tom70作为胞质伴侣蛋白和辅伴侣蛋白对接位点,参与线粒体生物体内新合成的伴侣结合蛋白形成,同时也是新合成线粒体内膜代谢物载体的主要连接受体,Tom70能够识别大量代谢物载体[19]。近年来对mRNA转录和蛋白质水平筛查显示,Tom70在人类病理性心肌肥厚样本和高脂诱导DCM大鼠心肌模型表达都下降[20]。在动物实验中有研究发现,Tom70能够降低DCM心肌线粒体中ROS的产生,高水平ROS和线粒体融合的重要介质——内膜蛋白光学萎缩-1(Opa1)的输入减少,会引起线粒体功能异常,这种异常是由于DCM模型小鼠心脏细胞中Tom70的mRNA水平和蛋白质表达降低引起的[21]。Tom70的TPR结构域能与热休克蛋白Hsp70 和Hsp90分子伴侣结合,当Tom70功能正常时,与Hsp90分子伴侣相结合参与三羧酸循环,完成柠檬酸合成酶由胞浆向线粒体内转运,从而起到对心肌细胞的保护作用[22]。

临床研究显示[23],药物二甲双胍可通过激活Tom70来减轻线粒体功能障碍和氧化应激水平,进而改善心脏微血管内皮细胞损伤(CMECs)。Amanda Lochner[24]研究表明褪黑素对缺血性/再灌注型心肌损伤有治疗作用,可能是通过激活褪黑素受体-PGC1alpha-Tom70信号通路来改善氧化应激引起的线粒体碎片化的心肌损伤,褪黑素受体作用的发挥依赖于Tom70对前体蛋白的转运功能正常发挥。综上,Tom70有望成为临床上治疗改善DCM线粒体损伤的新靶点。

2.2 Tom70 通过抗氧化调节线粒体功能到达改善DCM目的

Tom70主要功能是促进线粒体前体蛋白的导入,这些前蛋白参与氧化应激和线粒体功能的调节,线粒体功能障碍会导致严重的氧化应激。Tom70过表达可以减轻高脂高糖培养基诱导的心肌细胞的氧化应激、线粒体功能障碍和细胞凋亡;上调Tom70可改善DCM模型db/db小鼠的心肌肥厚、间质纤维化和心室功能障碍等症状[25]。同时也被证实,Tom70缺乏会导致线粒体内超氧化物产生和线粒体肿胀、线粒体嵴断裂,以及外膜破碎,从而抑制线粒体呼吸作用,引发心肌细胞ATP生成减少和ROS上升;通过DHE和MitoSOX实验分别检测到,高脂高糖诱导的DCM大鼠心肌细胞线粒体内超氧化物水平上升,引起线粒体功能障碍,表现为线粒体膜电位和ATP水平降低;敲除Tom70后,会显著增强DCM大鼠心肌细胞产生的超氧化物水平,提示Tom70通过减轻线粒体氧化应激水平和改善线粒体形态及呼吸功能达到抗心肌细胞凋亡和改善线粒体功能的作用[26]。在临床上高糖诱导的人类大血管主动脉内皮细胞(HMAECs)中TLR2和TLR4的高表达,DCM中心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞(VSMC)暴露于高糖环境会通过增加TLR4、髓样分化因子88(MyD88)和NF-κB的蛋白水平和活性触发TLR4信号,从而增加心肌细胞内ROS的产生,而高表达TOM70可通过抗氧化应激预防心肌肥厚、纤维化和心室功能障碍,同时在维持ATP生成和线粒体膜电位方面保护线粒体功能正常发挥,其临床具体机制有待进一步研究[27]。

在与心脏相关的其他疾病中,Tom70同样在抗氧化应激和保护心肌线粒体功能中发挥重要作用。在缺血性心肌病中,Tom70减少导致缺血心肌中ROS显著增加,ROS是心肌梗死后促凋亡的介质;Tom70通过稳定线粒体结构和功能来调节梗死心肌的ROS和凋亡[28]。有研究者在人类病理性心肌肥厚性心脏病对已知的Tom复合基因进行了mRNA筛选,研究显示,Tom70表达降低可能是诱导肥厚性心肌病患者走向终末期心力衰竭的主要原因,同时在动物和细胞试验中,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸和过氧化氢酶的应用显著改善了心肌细胞增大以及ANP、BNP和α-MHC的表达,研究证实氧化应激可能是血流动力学超负荷和G蛋白偶联受体激动剂刺激引起的病理性心肌肥大的共同病理机制,Tom70的减少导致病理性大鼠心肌细胞肥大模型(NRVM)中ROS明显升高;线粒体内膜的Opa1缺陷引起的线粒体融合异常会导致Tom70缺乏,是引起氧化应激和线粒体形态异常的基础,而引起Opa1在线粒体导入功能异常的原因是Tom70在线粒体外膜靶向导入缺陷[29]。

2.3 Tom70 通过抗凋亡调节线粒体功能到达改善DCM目的

细胞坏死性凋亡是由特异性死亡受体检测到细胞外或细胞内微环境紊乱而引发的调节性的细胞死亡形式,与DCM关系密切。特异性阻断高糖诱导的DCM心肌细胞坏死性凋亡能够减轻DCM心肌细胞毒性、线粒体损伤和ROS水平,用ROS清除剂显示能够降低DCM心肌细胞毒性、坏死性凋亡下游分子RIP3的表达[30]。说明DCM心肌细胞中ROS水平和心肌细胞凋亡相互影响,对线粒体功能和心肌产生损害。线粒体被认为是细胞“凋亡总部”,它们分裂成比之更小的结构在细胞死亡程序中至关重要。心肌细胞中的线粒体是心肌缺血的主要靶向亚细胞器,保持线粒体功能和形态的完整性可以减轻心肌梗死损伤和心肌细胞凋亡。

Tom70具有四个C-末端四三肽重复序列(TPR)基序,用于识别细胞质中的线粒体前蛋白的内部靶向信号(很多是内膜代谢物载体),然后将它们转移至相应线粒体内部,Tom70基因敲除可能会干扰线粒体蛋白质运输和引发心肌细胞细胞凋亡,从而加重心肌损伤[28]。有学者在细胞水平上建立高脂高糖介导的DCM心肌细胞模型,通过Tom70 siRNA技术抑制Tom70表达,结果显示凋亡相关分子Caspase3、Caspase9表达增加,说明Tom70抑制后加重高脂高糖介导的DCM心肌细胞凋亡[26]。高糖诱导下人类视网膜毛细血管内皮细胞Tom70基因表达显著降低,其与线粒体转录因子A(TFAM)的结合也低于正常水平。结果表明,TFAM向线粒体的运输而使线粒体损伤,电子传递链功能失调,导致线粒体运输系统功能失常可能引细胞凋亡。从以上研究中可以看出,Tom70的抑制会干扰线粒体前蛋白的传输,导致DCM心肌细胞损伤和线粒体运输功能障碍,引发心肌细胞凋亡。未来以与Tom70相结合的线粒体转运蛋白为靶点的治疗策略有望改善线粒体生物合成功能[31]。

3 Tom70与“诸湿肿满,皆属于脾”的关系

3.1 Tom70缺陷是“诸湿肿满,皆属于脾”的物质基础

Tom70缺陷导致心肌细胞线粒体受损,线粒体中葡萄糖转化为游离脂肪酸(FFA)氧化磷酸化后产生ATP的能力减弱,引发线粒体活性氧增加,心肌线粒体功能异常,直接引起脾胃运化水谷和水液功能失常,形成痰湿、瘀血阻遏心脉;同时Tom70缺陷导致脾失运化,水谷精微物质在中焦郁结不得疏泄,而生瘀毒、浊毒、湿热毒,导致胰岛素抵抗、高胰岛素血症和脂肪毒性增加等,引发心肌细胞发生变性、肥大、纤维化及局灶性坏死;心脏血管舒张功能障碍还有炎症发生,引发心脏舒缩功能障碍的DCM。临床上可表现为心源性水肿、心悸心慌、心肌缺血性心绞痛等症状。

3.2 Tom70缺陷导致脾阳受损,运化失司

把Tom70作为阐释DCM病机“诸湿肿满,皆属于脾”的切入点的理论机制在于线粒体外膜上的Tom70的缺陷会干扰线粒体蛋白质的向内转输,使线粒体形态受损,超氧化物生成增多,导致线粒体呼吸链酶功能异常生成ATP不足。ATP生成不足的中医病机为脾阳受损,引发水湿停聚,上则不能通过肺气调畅三焦气机,水道不通停而聚为水湿和瘀血,临床表现为“全身水肿”“胸腹胀满疼痛”、水湿引起的“咳、喘、哮”等;下则肝肾之气不能随脾阳升清而上升,肾气滞留,膀胱失约,而导致水湿留于下焦,临床表现为“风水”“皮水”,下肢水肿较为明显,小便不利。

3.3 Tom70调节脾主运化来治疗DCM引起的“诸湿肿满”

从以上研究中发现,抑制Tom70表达会导致心肌细胞凋亡和线粒体损伤,加重DCM发展;高表达Tom70会减轻心肌细胞线粒体氧化应激,缓解DCM进程。而脾与心肌线粒体的功能密不可分,脾运化功能失常,心肌微血管AGEs沉积、炎症因子、ECM和脂质沉积引发慢性炎症反应(毒邪蕴结于心脉)则会引起线粒体呼吸功能障碍和产能减少,进一步引发心肌细胞凋亡,影响心脏舒缩供血功能。因此本研究认为,脾失运化引起的DCM,与心肌线粒体损伤相关,而线粒体外膜上的Tom70表达下降会干扰线粒体蛋白质运输,诱发心肌细胞氧化应激和凋亡发生,心脏功能障碍引发心源性水肿、胸闷心慌。而以Tom70和与Tom70相结合的线粒体转运蛋白为靶点研究,抗凋亡和抗氧化应激治疗DCM有望成为调节脾失运化,改善“诸湿肿满”的新方向。

4 结语

综上,“诸湿肿满,皆属于脾”在DCM中的具体病机为脾失运化(脾-心肌线粒体功能失常),导致痰浊、水湿、瘀血(AGEs、ECM、炎症因子、ROS沉积)闭阻心脉,引发心肌舒缩功能障碍以及冠状动脉病变,产生“湿、肿、满”的临床症状。Tom70可以通过脾主运化(抗氧化和抗凋亡)来改善心肌线粒体的形态和功能损伤,以期成为治疗DCM的新靶点。