分子印迹固相萃取–高效液相色谱法的优化及在测定植物油中苯并(a)芘含量的应用

李文廷，刘 玲,2，夏加恩，董玉英，冉亚莉，赵 丽✉

（1. 昆明市疾病预防控制中心，云南 昆明 650228；2. 昆明医科大学 公共卫生学院, 云南 昆明 650500；3. 昆明市东川区疾病预防控制中心, 云南 昆明 654100）

食用植物油是居民膳食的重要组成部分，也是补充人体所需营养物质的重要来源[1-2]。据报道中国居民平均每标准人日食用植物油的摄入量为37.1 g，食用油与人们的生活、健康息息相关，随着经济社会的发展及人们营养健康意识的增强，植物油在人体健康与疾病预防方面的影响受到极大重视，食用油的质量和安全性问题主要来自油料作物的种植、收获、储存、加工和使用等环节，特别是食用油品在加工环节的污染状况引发人们的广泛关注[3-5]。

苯并(a)芘[benzo(a)pyrene]为多环芳烃类化合物，是世界上排名前三的强烈致癌性物质。苯并芘是由脂肪、胆固醇、蛋白质和碳水化合物等在高温烘烤、干燥、熏制和烹调（煎、炸、烤、炒等）加工过程中，发生热裂解、环化和聚合等反应形成，主要通过饮食进入人体，对人体很多器官例如眼睛，乳腺等造成危害[6-10]。我国标准GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》[11]规定了植物油中苯并(a)芘的限量为10 μg/kg。许多植物油如芝麻油、亚麻籽油、菜籽油等加工工艺采用压榨法需要高温炒籽，若温度控制不佳就易导致苯并(a)芘超出国家限量标准[12-13]。地沟油中苯并芘的检出率及超标率均保持高位值，并且地沟油流入市场的事件也是时有发生[14]，因此，对于食用植物油中苯并(a)芘的检测尤为重要，保障居民对植物油食用的安全性。

目前，苯并芘的检测方法主要有荧光分光光度法、高效液相色谱、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用法等[15-22]，荧光分光光度法的样品前处理步骤较为复杂，灵敏度较低，质谱法中苯并芘的碎片特征离子峰响应值较低，不易进行定性定量，而液相方法具有较高的灵敏度及较便捷的样品处理方法。食品安全国家标准方法 GB 5009.27—2016《食品中苯并(a)芘的测定》[23]推荐的检测方法主要是利用中性氧化铝固相萃取小柱或分子印迹固相萃取小柱对样品进行净化。中性氧化铝固相萃取柱对于其他种类的样品较为理想，但通过实验分析后，对于食用植物油的处理仍存不足之处，样品过柱经氮吹或旋转蒸发浓缩时，油脂较难去除，耗时较多，影响后续上机测定分析，对于批量样品的监测较难开展，而使用分子印迹固相萃取净化柱进行样品前处理，具有操作便捷，有机试剂消耗较少，省时高效，样品处理后净化效果相对比较高，干扰色谱峰较少。有文献报道采用分子印迹固相萃取小柱对植物油苯并芘的萃取净化效果验证[24]，通过两种固相萃取净化柱比对植物油中苯并芘的净化效能[25]，使用串联固相萃取净化小柱去除油脂干扰成分研究[26]，而本文针对以上方法中存在的问题缺点以及结合实验分析过程中检测技术进行了研究，通过两种固相萃取净化效果分析，最佳检测波长的选择，多种流动相配比分离效果研究以及不同规格色谱柱选择的考察，最终确定相关色谱技术的优化条件，针对植物油样品建立具有分析简单、高效便捷、准确性好、回收率高等优点测定苯并(a)芘的方法，使其应用于特别是批量的食用植物油样品中苯并(a)芘的准确定量，对相关基层检测部门具有指导意义，为政府职能部门提供技术及数据支持，保障居民的食品安全及大众健康。

1 材料与方法

1.1 实验样品

本实验样品：市售抽查样品，包括30件菜籽油、5件花生油、4件芝麻油、1件玉米油、1件核桃油，共计 41件，其中 83%的样品采集于农贸市场小作坊制作成品。

1.2 仪器与试剂

超高效液相色谱仪U3000：美国ThermoFisher公司；分析天平XS205DU：瑞士Mettler Toledo公司；智能台式高速冷冻离心机3H16RI：湖南赫西仪器装备有限公司。

标准物质苯并芘：中国计量研究院；中性氧化铝柱和分子印迹柱：普瑞邦（中国）公司；甲醇和乙腈均为色谱纯。

1.3 色谱条件

色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×150 mm, 5.0 μm），柱温为 35 ℃，激发波长：365 nm，发射波长410 nm，流动相A相：乙腈，B相：水，流动相配比为90%乙腈+10%水，流速为1.0 mL/min，进样体积为20 μL，分析运行时间为10.0 min。

1.4 实验方法

1.4.1 标准溶液配制

乙腈中苯并(a)芘标准使用液(100 μg/L)：准确定量量取苯并(a)芘标准物质于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，用于标准曲线制作实验分析，避光保存在0～5 ℃的冰箱中。

1.4.2 样品前处理

称取0.400 g植物油样品，加入5.0 mL正己烷并旋涡混合0.5 min，采用苯并(a)芘分子印迹柱进行固相萃取净化，先依次用5.0 mL二氯甲烷及5.0 mL正己烷将柱子活化，样品溶液转移到柱子，待液面降至柱床时，用6.0 mL正己烷淋洗柱子，弃去流出液。用6.0 mL二氯甲烷洗脱并收集，接着在40 ℃下氮气吹干，准确吸取1.0 mL乙腈涡旋复溶0.5 min，过0.22 μm滤膜后待测。

1.5 数据分析

采集到的数据使用Chromeleon 7.lnk进行定性定量分析，样品分析时通过样品色谱峰保留时间进行定性，通过峰面积进行定量。

2 结果与分析

2.1 净化方法的选择

进行两种净化柱净化效果的考察，样品经正己烷溶解过中性氧化铝柱，洗脱后分别采取直接氮吹法和减压旋转蒸发法两种方法进行浓缩，经1 h长时间的浓缩均较难将油脂彻底去除，经乙腈复溶后，提取效果欠佳，整个前处理步骤所需溶剂及处理时间均较多，严重影响工作效率，不适宜批量样品的处理。苯并芘分子印迹柱净化实验则较为高效，且净化效果相对较为理想，样品通过柱子净化洗脱后，可直接进行氮吹浓缩，10 min即可近干，加入乙腈溶解过滤膜后即可上机测定分析，所需试剂及处理时间均较少，显著提高了工作效率，特别适用于大批量样品的处理，因此采取苯并芘分子印迹柱净化方法进行样品前处理，净化效果如图1所示。

图1 加标样品经固相萃取净化后的色谱图Fig.1 Chromatograms of spiked samples purified by solid phase extraction

2.2 检测波长的考察

根据文献查阅，目前苯并芘的检测波长各异，通过选择不同的激发波长（Excitation wavelength，Ex）和发射波长（Emission wavelength，Em），在相同色谱条件对 10.0 μg/L苯并芘标准溶液进样1.0 μL进行测定考察分析，如表1实验数据显示，苯并芘的响应强度具有较大差异，在Ex / Em 384 nm/406 nm的条件下，虽然具有较大响应强度，但也具有较高的噪声值，进而使信噪比降低，综合信噪比数据，选择Ex / Em 365 nm/410 nm为苯并芘的测定波长，具体色谱图见图2。

图2 不同检测波长的色谱图Fig.2 Chromatogram at different detection wavelengths

表1 不同检测波长的色谱参数Table 1 Chromatographic parameters for different detection wavelengths

2.3 流动相考察

分别对流动相组成和配比进行考察，如图3所示，当有机相为乙腈时，随着有机相比例增加，苯并芘色谱峰保留时间逐渐变小。当有机相为甲醇时，苯并芘的分离情况相对较差，但混合乙腈时有较大改善，具体实验数据见表2。

图3 不同流动相的色谱图Fig.3 Chromatogram of different mobile phases

表2 流动相考察Table 2 Mobile phase inspection

改变流动相配比情况进行目标化合物分离效果分析，80%甲醇洗脱的色谱峰已经出现较大峰宽，峰型出现前沿及不对称情况，70%甲醇洗脱时已没有明显的色谱峰显示，60%乙腈和60%甲醇进行冲洗，未检测到色谱峰，根据色谱图出峰情况分析，从图中可以看出，乙腈作为流动相比较适合苯并芘的洗脱，具有较高的响应，甲醇作为洗脱流动相未有理想的洗脱效果，因此选择90%乙腈–10%水作为苯并芘的洗脱流动相。具体谱图情况如图3所示。

由于样品基质较为复杂，从样品加标回收实验的色谱图图4可以看出，前期有较大的溶剂杂质峰，若再增加有机相的比例，目标峰和杂质峰将会重叠，达不到目标峰的分离效果，所以不适合用纯的有机相进行苯并芘的洗脱。

图4 样品加标回收色谱图Fig.4 Standard-added recovery chromatogram

2.4 色谱柱选择

分别考察了采用Phenomenex C18柱（4.6 mm×250 mm, 5.0 μm）250 mm 及 Agilent Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×150 mm, 5.0 μm）对样品进行检测分析情况，根据检测结果分析不同色谱柱柱效，使用相同的流动相条件进行洗脱时，短柱子能有效提高工作效率，减少试剂的使用量，经济环保。如图5显示，色谱峰保留时间具有较大差异，所以选择150 mm的柱子进行实验分析。

图5 不同柱长的分离色谱图Fig.5 Separation chromatograms of different column lengths

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系

用乙腈将苯并芘标准使用液稀释制备成浓度为 0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L 的标准系列溶液，在上述条件下进行测定，以浓度X为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线进行线性回归，在0.3～20 μg/L 范围内具有良好的线性关系，线性方程为y=6 640.404 4x+0.301 7，相关系数r=0.999 9。标准曲线色谱图重叠图见图6所示，保留时间标准偏差为 0.35%，说明重复性较稳定，以 3倍信噪比计算得方法检出限0.05 μg/kg，以 10倍信噪比得方法定量限 0.10 μg/kg，满足实验室检测定量要求。

图6 标准曲线色谱重叠图Fig.6 Standard curve chromatogram overlay

2.5.2 方法回收率

选取苯并芘本底值未检出的样品，进行分子印迹柱净化方式的加标回收实验，加入标准物质使浓度为1.0、5.0、10.0 ng/mL，按照样品前处理条件进行处理并上机测定，每个添加浓度做6个平行实验，方法的平均回收率为87.6%～95.9%，RSD为1.08%～2.16%，数据见表3，实验数据表明分子印迹柱净化方法具有较高的回收率，相对标准偏差较小，处理植物油中苯并芘较为理想。

表3 苯并芘的加标回收率和精密度（n=6）Table 3 Scaling recovery rate and precision of benzopyrene (n=6) %

2.5.3 方法重复性

选取苯并芘本底值检出的样品进行重复性实验分析，精确称取样品6份，按照样品前处理条件进行实验分析，计算相对标准偏差作为方法的精密度，精密度为 1.13%，表明实验方法的重复性较强。检测数据见表4。

表4 苯并芘的精密度（n=6）Table 4 Precision of benzopyrene (n=6)

2.6 实际样品检测

按照上述实验方法对市场销售的 41份样品进行检测，检出16份，检出率为39.0%。其中菜籽油检出为13份，菜籽油检出率为43.3%，占检出样品的 81.2%；花生油、芝麻油和核桃油各检出1份，分别占检出样品的6.2%。散装样品检出9份，散装样品检出率为 47.4%，占检出样品的56.2%；预包装样品检出 7份，预包装样品检出率为 38.9%，占检出样品的 43.8%。根据国家标准GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》规定，植物油中苯并(a)芘的限量为10 μg/kg，共计 1份样品超过标准限值，超标率为2.4%。检测结果说明散装植物油的检出率比预包装的高，菜籽油的检出率远高于其它类型的植物油，超标的样品为榨油小作坊制造的散装菜籽油。实验测定结果表明，所采集的植物油合格率为97.6%，整体上植物油的食用较为安全。

3 结论

通过优化的分子印迹固相萃取超高效液相色谱检测方法对植物油中苯并（α）芘含量进行检测分析，实验结果表明，分子印迹固相萃取柱更加适合处理植物油样品，样品经分子印迹柱萃取净化后干扰基质较少，采用优化的检测波长及流动相条件，苯并芘具有较好的色谱峰响应值及信噪比，选择短程柱子能有效提高工作效率。该方法具有回收率高，精密度好，结果稳定，操作过程便捷，所需时间及试剂均较少，对环境比较友好，便于提高日常检测工作效率，更加满足于当前快节奏、多任务和样品量多的检测要求，适用于食用植物油中苯并芘的批量检测及污染监测情况分析。但该方法中所使用的固相萃取柱存在成本问题，后续可开展液液萃取样品中苯并芘的研究，减少检测成本的投入，更加简化样品的前处理步骤，提高工作效率。