肺结核患儿胃液样本结核分枝杆菌培养阳性率提高方法的探讨

李桂莲 方敏 姜靖伟 王瑞欢 钱程宇,3 于晋杰,4 曹滨,4许达 赵秀芹 李马超 刘海灿 孙琳 朱渝 万康林

据世界卫生组织估计，2021年全球儿童结核病发病和死亡例数分别占总发病例数和总死亡例数的11%和14%[1]。儿童结核病的流行情况不仅反映一个国家或地区近期人群结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的感染现状，还可以作为远期结核病疫情的预测指标。因此，应加强对儿童结核病的预防、诊断、治疗和管理。近年来，以MTB核酸为检测靶标的分子生物学检测技术及以机体特异性结核免疫应答为检测靶标的γ-干扰素释放试验的广泛应用大大提高了儿童结核病的检出率。但应注意到，培养获取MTB依然是儿童结核病诊断的“金标准”及开展后续检测和研究的基础。耐药监测，传染源、暴发和流行的认定，以及研究儿童结核病的发病机制均依赖于MTB的获得。由于肺结核患儿不会咳痰或痰菌载量小，以及低龄患儿往往将痰液吞咽至消化道中等原因，致使胃液替代痰液成为儿童特别是学龄前儿童肺结核患者进行病原学检测的重要样本类型。但目前儿童结核病的培养阳性率普遍偏低，因此，优化胃液样本MTB培养和鉴定的实验流程，有助于提高儿童结核病病原学确诊率。

传统的MTB培养方法包含碱处理步骤，该步骤可起到杀灭杂菌和释放样本中MTB的作用，同时，可以起到中和胃酸的作用。尽管样本-碱处理混合液经磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS；pH=6.80)中和离心后再进行接种，但碱处理过程可能会导致样本中的MTB失活或丢失进而影响检出率。因此，笔者设计了MTB培养的“两步法”，即：先直接进行MTB培养，在培养基上增菌后再行碱处理，以期提高MTB的阳性检出率。同时，样本-混合液经PBS调节后的pH值可能会影响分离培养的阳性率及新型菌种鉴定方法(MTB抗原-胶体金法)的结果准确率。为进一步验证，笔者通过模拟样本探讨pH值改变对MTB抗原-胶体金检测卡判读结果的影响，以及PBS缓冲液对样本-碱性前处理混合液pH值的调节作用，以期优化当前肺结核患儿胃液标本的MTB培养和鉴定流程。

资料和方法

一、研究对象

采用回顾性研究方法，搜集2019年7月至2020年7月就诊于四川省凉山彝族自治州第一人民医院、四川大学华西第二医院和首都医科大学附属北京儿童医院入院治疗的疑似肺结核患儿作为研究对象，其中，经临床综合诊断为肺结核者68例(病例组)，其他呼吸系统感染性疾病者2例(对照组)。研究对象的纳入和排除标准参考文献[2]。患儿于入院第2天晨起空腹采集胃液。胃管经鼻进入胃中，采用注射器抽取2～8 ml胃液，分装后于-80 ℃保存，用于后续细菌培养。本研究方案经首都医科大学附属北京儿童医院伦理委员会批准(2018-96)，所有研究对象的监护人均签署知情同意书。

二、主要试剂

1.主要试剂：Middlebrook 7H9液体培养管、OADC营养添加剂和PANTA抑菌剂购自美国BD公司。MTB抗原-胶体金检测卡购自杭州创新生物检控技术有限公司。KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaOH和HCl分别购自广东省精细化学品工程技术研究开发中心、国药集团化学试剂有限公司、北京市通广精细化工公司和北京化工厂。Xpert Ultra购自美国赛沛公司。

2.主要试剂配制：(1)OADC-PANTA混合液：按说明书将15 ml OADC营养添加剂与适量 PANTA抑菌剂混合，使用前新鲜配制，每支MGIT 960培养管分装0.8 ml。(2)PBS溶液(pH=6.8)：称取KH2PO44.559 g，Na2HPO4·12H2O 11.9977 g，定容至1000 ml蒸馏水，用梅特勒-托利多FE20酸度计[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]检测pH值为6.84，高压灭菌配用。(3)3%或4%NaOH溶液：称取3 g或4 g NaOH，定容至100 ml，高压备用。(4)1%HCl：取1 ml纯HCl，加入到99 ml去离子水中。

三、研究方法

1.分枝杆菌培养：每份2 ml胃液样本中分别取1.8 ml用于传统培养法，0.2 ml用于两步培养法。以传统培养法为标准，评价两步法的检出效率。(1)分枝杆菌传统培养法：即临床上常用的碱处理-中和离心法。1.8 ml胃液样本用等体积的4%NaOH-2.9%枸橼酸钠-0.5% N-乙酰半胱氨酸混合液处理15～20 min后，加入适量PBS缓冲液(pH=6.8)定容至45 ml；4 ℃，4000×g离心15 min。弃掉上清，加入2 ml PBS缓冲液(pH=6.8)混匀，分别取0.2 ml和0.5 ml接种于改良罗氏培养基和7H9培养管中。罗氏培养基置37 ℃培养箱培养至肉眼可见菌落生长，阴性者观察满8周；7H9培养管置BACTEC MGIT 960快速培养系统中培养至系统报阳，阴性者观察满38 d。(2)分枝杆菌两步培养法：0.2 ml胃液直接接种于改良罗氏培养基斜面上，置37 ℃培养箱培养至20～30 d，如有可疑菌落生长，挑取菌落按照传统培养法继续培养。

2.两步培养法在不同菌载量样本中阳性率的确定：为分析两步培养法在不同含菌量样本中的阳性检出率的差异，本研究还对胃液样本进行Xpert Ultra 检测，以其报告的结果作为样本菌载量的标准。实验在北京儿童医院进行，根据产品说明书进行操作。取胃液2 ml于无菌离心管中，加入等量3%NaOH溶液进行中和。充分振荡10～15 s后室温放置15 min，期间每5 min再充分振荡混匀1次。置于离心机中4000×g离心15 min。弃上清，离心管中加入2 ml处理液，将剩余的沉淀吹打混匀后加入检测盒中上机检测。当MTB DNA检测阳性时，依据MTB的Ct值间接反映所检测样本中的菌载量，分为高、中、低、非常低、微量。

四、MTB抗原-胶体金检测

采用MTB抗原-胶体金检测卡参照说明书对分枝杆菌菌株进行菌种鉴定。采用盐酸和去离子水配制pH值分别为5、6、7、8、9和10的溶液作为模拟样本，取100 μl加入检测孔中，静置15 min后观察质控线和检测线显色情况，以确定检测卡检测效果最佳时样本的最适pH值。实验重复2次，比较结果的一致性。

五、样本-碱性前处理混合液pH值的调节

由于碱处理法是进行MTB分离培养样本前处理的常规方法，样本经碱处理后通常采用PBS缓冲液(pH=6.8)进行中和及离心后的样本重悬。合适的样本-碱性前处理混合液的pH值有利于提高样本的分离培养阳性率，同时，液体培养基的pH值可能会影响MTB抗原-胶体金检测卡的结果判断。为保证样本-碱性前处理混合液的pH值在可接受范围内，分别配制4.0%和3.0%的NaOH溶液，并用1%的HCl溶液(pH=0.6)和去离子水分别模拟胃液样本和中性的痰样本，将不同浓度的碱溶液与模拟样本等量混合后，用PBS缓冲液进行不同倍数稀释，并用梅特勒-拖利多FE20酸度计检测不同稀释倍数下的pH值(溶液温度为22.0～23.5 ℃)，以确定碱处理样本混合液的最佳稀释倍数。实验重复2次，取平均值。

六、统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行数据分析。计数资料以“百分率/构成比(%)”描述，组间差异的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两种方法阳性检出情况

68份病例组样本中，18份经传统培养法检测为阳性，其中，3份样本分离获得菌株较早，认为无开展两步法的必要而未进行两步法的第二步检测。病例组其余65份样本中15份经两步法检测为阳性。2份对照组的样本两种方法检测均未发现阳性。两种方法共分离菌株22株，其中，传统培养法单独培养阳性7株(含从未进行两步法检测的样本中分离到的3株菌株)，两步法单独培养阳性4株。传统培养法阳性检出率为26.5%(18/68)，两步法阳性检出率为23.1%(15/65)，未发现两种方法的阳性检出率差异有统计学意义(χ2=0.125，P>0.05)。两步法在传统培养法的基础上将阳性检出率从26.5%(18/68)提高到32.4%(22/68)。

二、不同菌载量标本两种方法阳性检出情况

以Xpert Ultra检测菌载量为标准进行标本分类，传统培养法和两步法在菌载量低级及以上分级样本中的阳性检出比例均明显高于菌载量极低级及以下标本的阳性检出比例，差异均有统计学意义(χ2值分别为13.082和7.896，P值分别为0.000和0.005)。仅在两步法中培养阳性的样本其菌载量在低级及以下。具体见表2。

表1 不同菌载量分级标本经传统培养法和两步法的阳性检出情况

三、菌种鉴定结果及pH值改变对MTB抗原-胶体金检测卡判读结果的影响

共培养出22株菌株，经MTB抗原-胶体金检测卡鉴定，其中，21株被鉴定为MTB，1株被鉴定为非结核分枝杆菌。在使用MTB抗原-胶体金检测卡进行鉴定的过程中发现，质控线和检测线的颜色深浅不一。进一步用不同pH值的模拟样本进行验证，结果发现，当pH值在6～9之间时，胶体金检测卡质控线阳性(显色强度正常)，检测线为阴性，和预期结果一致；当pH值为4和5时，除质控线显示阳性外，检测线亦显示出弱阳性，此时判断结果容易发生假阳性现象；当pH值为10时，质控线显色较弱，呈弱阳性，此时判断结果容易发生假阴性现象。具体见图1。

注 当pH值在6～9之间时，胶体金检测卡质控线阳性(显色强度正常)，检测线为阴性，和预期结果一致；当pH值为4和5时，除质控线显示阳性外，检测线亦显示出弱阳性，此时判断结果容易发生假阳性现象；当pH值为10时，质控线显色较弱，呈弱阳性，此时判断结果容易发生假阴性现象图1 pH值改变对结核分枝杆菌抗原-胶体金检测卡判读结果的影响

四、样本-碱性前处理混合液pH值的调节

将2 ml模拟胃液样本(1% HCl)与等量3%或4%的NaOH溶液混合后，用PBS缓冲液(pH=6.8)进行系列倍数的稀释，当稀释倍数达到原来的10倍或14倍时，混合液的pH值降到10以下；当达到原来的12倍或16倍时，pH值降到8以下。将2 ml 模拟痰样本(去离子水)与等量3%或4%的NaOH溶液混合后，同样进行稀释，当稀释倍数达到原来的12倍或16倍时，混合液的pH值降到10以下；当分别达到原来的14倍或18倍时，pH值降到8以下。结果见表2。

表2 磷酸盐缓冲液稀释碱处理样本混合液(4 ml)后的pH值改变情况

为验证样本初始体积对中和混合液的pH值的影响，进一步将4 ml HCl(浓度为1%)与等体积的4% NaOH溶液混匀后，同样用PBS缓冲液进行系列稀释，pH值依次为13.08(2倍)、12.63(4倍)、12.08(6倍)、11.60(8倍)、11.21(10倍)、10.65(12倍)、8.73(14倍)、7.89(16倍)、7.62(18倍)、7.46(20倍)、7.36(22倍)、7.29(24倍)、7.23(26倍)、7.18(28倍)和7.14(30倍)，不同稀释倍数的pH值分布与2 ml HCl(浓度为1%)+2 ml NaOH(浓度为4%)混合液的相似。

讨 论

本研究根据胃液的特性，设计了一种利用胃液样本进行分离培养的两步法，尽管其阳性检出率未优于传统培养法且工作量和试剂费用高于后者，但观察到其能分离到传统培养法未分离到的菌株，可作为传统培养法的补充应用于高度怀疑但难以诊断的儿童结核病患者或科学研究中。同时，本研究还发现MTB抗原-胶体金检测卡使用的最适pH值范围介于6～9之间；证实胃液模拟样本经3%或4%的NaOH处理后，若调节其pH值至7～9时，需使用PBS缓冲液(pH=6.8)稀释至少10或14倍，而痰液模拟样本经3%或4%的NaOH处理后，若调节其pH值至7～9时，需使用PBS缓冲液(pH=6.8)稀释至少12或16倍。这些研究结果为规范我国MTB的分离培养提供了科学依据。

肺结核是危害儿童健康的严重疾病。儿童咳嗽反射弱，排痰量少，经常将呼吸道分泌物直接吞咽；婴幼儿在入睡时，呼吸道的纤毛运动将含有MTB的痰液送至喉部，然后吞咽至胃内，在整个夜间会咽下大量呼吸道分泌物，而且夜间胃液分泌量明显减少，因此，胃液被认为是较好的诊断儿童肺结核的样本类型[2]。胃是消化道微生态系统中的一个特别区域，由于胃酸的分泌形成了其独特的生态环境和特征性的微生物群落。宏基因组检测显示胃液样本中存在约200多种细菌[3-4]，远低于呼吸道样本的369种[5]。虽然宏基因组测序结果显示临床样本中微生物的种类较多，但在分离培养时由于受到培养基的营养条件、培养温度及菌株的生长特性等影响，分离到的细菌种类远小于宏基因组测序获得的结果。本研究采用的罗氏培养基含有5%的孔雀绿，具有一定的抑制杂菌生长的作用。而且结核可疑样本的处理通常采用碱处理法，在处理过程中会造成MTB的丢失或失活，从而造成假阴性结果。综合以上因素，本研究建立了直接将胃液接种于罗氏培养基进行选择性增菌后，再将培养基上可疑MTB培养物进行碱处理-中和离心处理的两步法。

分离培养两步法的实验结果显示，其阳性检出率和传统培养法相比，差异未见统计学意义，而且在传统培养法的基础上使所有结核病患儿样本的阳性检出率提高了5.9%。但两步法在4份传统培养法检测阳性的样本中检测结果为阴性，推测是由于其他的细菌生长快速旺盛，对MTB的生长形成竞争性抑制作用，导致MTB无法生长所致。本研究还发现传统培养法和两步法在菌载量级别为低级及以上的样本中的阳性检出比例均高于菌载量极低级及以下的样本，说明两步法和其他方法一致，菌载量越高的样本越容易被检出。虽然本研究中两步法的阳性检出率未见优于传统培养法，但因其能分离到传统培养法未分离到的菌株，特别是在菌载量低的样本中单独分离到菌株，说明该法在结核病诊断中有一定的使用价值。但两步法检测过程较传统培养法复杂，工作量及试剂消耗费用等增加，结果报告时间延长，不适合临床常规使用。因此，笔者推荐对临床难以诊断的高度可疑患者或科研工作中亟需分离到菌株时用两步法进行检测，或对临床中传统培养法未分离到菌株的结核病患者将传统培养法和两步法结合，进行MTB的分离培养。这时在两步法的第一步中，也可尝试将罗氏培养基换成BACTEC MGIT 960培养管的方法。本研究的不足之处在于未能比较两步法在不同胃液形态、保存时间点和保存温度下的胃液样本的阳性检出率以确定胃液样本的最佳保存条件，因此，还需要作进一步研究。

在临床检验过程中，采用MTB抗原-胶体金检测卡对培养物进行菌种鉴定简便易行。然而，胶体金法是一种对pH值改变极为敏感的方法，过高或过低的pH值可能会使实验结果产生假阳性或假阴性[6-7]。在对阳性的BACTEC MGIT 960管的培养液进行菌种鉴定时，笔者发现不同样品的检测卡质控线深浅不一，推测这可能因个人胃液中的pH值不尽相同，经碱处理后的胃液样本接种使BACTEC MGIT 960管中培养液的pH值不同所致。笔者也对部分胃液样本直接接种到BACTEC MGIT 960管后的培养液进行了检测，结果发现，所有这些样本的胶体金检测卡的质控线和检测均出现了弱阳性。以上这些原因促使笔者采用模拟样本确定MTB抗原-胶体金检测卡的最适pH值范围。结果发现，当模拟样本的pH值<6时，胶体金试纸条的质控线和检测线均出现较弱的杂交反应，易导致假阳性的判断结果；当pH值>9时，质控线的杂交反应较弱，此时易导致假阴性的判断结果。由于结核可疑样本通常采用碱性前处理法，如果用PBS缓冲液中和的程度不足，在用BACTEC MGIT 960管的菌液进行菌种鉴定时容易导致假阴性结果，造成漏诊。而对于上述提到的胃液样本直接接种到BACTEC MGIT 960管引起的检测卡弱阳性事件，由于本研究用的均是结核病患者的胃液，尚不能分清是MTB导致还是胃液pH值低导致，这仅是促使笔者开展此项研究的原因之一。无论如何，MTB抗原-胶体金检测卡正确结果的判读依赖于菌液的pH值范围，需要保证菌液在合适的pH值范围之内(介于6～9之间)或对不确定的结果用其他方法辅助确定。

结核样本接种前通常采用碱溶液进行处理，然后采用pH值为6.8的PBS缓冲液进行中和。中和NaOH终浓度为1.5%或2.0%的胃液或痰液样本，所需要的PBS缓冲液体积不同。本研究发现，将2 ml的 3%NaOH或2～4 ml的4%NaOH和胃液样本等体积混合后，用PBS缓冲液调节混合液的pH值到10以下，前者至少需要稀释至初始混合液的10倍体积，而后者至少需要14倍。同样，用3%或4%的NaOH处理痰样本时，则至少需稀释至初始混合液的12或16倍。结合临床应用，笔者认为，若使7 ml的BACTEC MGIT 960培养管添加0.5 ml样本悬液(此处样本被稀释约15倍)后pH值在7～9之间，则酸性样本无论用3%或4%的NaOH处理、痰液样本经3%的NaOH溶液处理，中和离心倒掉上清后均可取少量沉淀重悬液直接接种；若用4%的NaOH溶液处理痰液(pH≈7)样本，则应先用PBS缓冲液进行至少3倍稀释和离心倒掉上清后，再取少量沉淀重悬液接种。如果接种的是罗氏培养基，由于通常使用的50 ml离心管最多使样本处理液稀释至12倍，而且最后倒掉上清这一步液体通常倒不干净，因此，建议无论是何种样本、何种浓度的NaOH处理均采用酸性罗氏培养基进行接种。本研究的不足之处在于未能对不同pH值的样本-碱处理混合液的分离培养阳性率进行比较。

综上，本研究发现，分离培养两步法的阳性检出率虽然未见优于传统培养法，但可作为传统培养法的补充，以提高胃液样本总的阳性检出率，尤其推荐对难以确诊的高度可疑肺结核患儿使用该方法进行检测。此外，本研究还提供了MTB抗原-胶体金检测卡使用的最佳pH值范围，以及不同临床样本经碱处理后调到合适pH值时需要用PBS缓冲液(pH=6.8)进行稀释的体积倍数。这些研究结果将为我国改进MTB培养技术提供基础科学依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献李桂莲：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、起草文章、统计分析、获取研究经费；方敏：采集数据、对文章的知识性内容作批评性审阅、支持性贡献；姜靖伟、于晋杰、曹滨、许达、赵秀芹和李马超：实施研究、对文章的知识性内容作批评性审阅、支持性贡献；王瑞欢和钱程宇：实施研究、对文章的知识性内容作批评性审阅、统计分析；刘海灿：分析/解释数据、对文章的知识性内容作批评性审阅、行政/技术/材料支持；孙琳和朱渝：采集数据、对文章的知识性内容作批评性审阅、指导；万康林：酝酿和设计实验、对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、指导