体外诱导对氨基水杨酸高浓度耐药结核分枝杆菌及其突变位点研究

余美玲 张晨晨 魏文静 赵雨川 卓文基 郑磊

对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid，PAS)是目前用于治疗耐多药结核病的二线抗结核药物[1]。尽管PAS用于结核病治疗已超过70年，但对其作用机制尚未完全了解[2]。目前，普遍认为结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)对PAS耐药主要与某些基因突变有关，包括thyA、folC和ribD等[3]。研究发现，thyA基因编码胸苷酸合成酶，其缺失可导致MTB对PAS的耐药性[4]，thyA基因的突变也存在于对PAS耐药的MTB临床分离株中[5]。作为对氨基苯甲酸(para-amino benzoic acid，PABA)的类似物，PAS与PABA竞争二氢叶酸合成酶 (DHPS)，从而干扰叶酸合成[6-8]。此外，也有研究显示，编码二氢叶酸合成酶的folC基因的各种错义突变和ribD的过表达可使MTB对PAS产生耐药性[9]。然而，folC突变仅在34.8%的MTB临床耐药分离株中被检测到，而thyA和ribD突变分别在26.0%和5.8%的MTB临床分离株中被检测到[5, 7]。

目前，MTB耐药研究多采用临床分离的药物敏感和耐药菌株进行对比分析[10-11]，难以消除不同菌株的背景差异，无法得知MTB耐药进化轨迹，亦无法准确获得MTB耐药变化的始动因素及引起耐多药的关键因素和共同因素。笔者采用世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐的改良罗氏固体培养法及药物敏感性试验(简称“药敏试验”)方法，制备不同药物浓度梯度的PAS培养基，通过连续传代和持续诱导的方式，将MTB标准菌株H37Rv成功诱导成标准耐PAS菌株(WHO推荐的耐药浓度)及高水平耐药菌株，收集并保存每一代诱导菌株，建立动态耐药菌株遗传进化模型。用微孔板法检测上述诱导菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)及交叉耐药情况，筛选耐药水平相似的临床分离株。通过对PAS耐药的实验室诱导MTB菌株和临床分离株进行全基因组测序，研究PAS潜在的作用和MTB对PAS的耐药新机制。另外，基于临床用药实际情况，构建连续、动态的耐PAS的MTB菌株模型，以期为MTB对PAS耐药研究和临床实践提供理想的生物模型。

材料和方法

一、研究材料

1.菌株：本研究所用MTB临床分离株来自广东省结核病控制中心生物样本信息库，菌株的PAS药敏信息齐全；MTB标准株H37Rv为本实验室保存。本实验室为省级结核病参比实验室，设有MTB菌株暂存库，按相关要求存储菌株；已在当地卫生健康委员会备案涉及病原微生物为MTB的二级病原微生物实验室[备案编号为：BSL-2(2020)44010600068]。少量活菌操作时在加强型二级生物安全实验室进行，实验人员进行三级防护。

2.试剂与培养基：实验所用Middlebrook 7H9培养基、Middlebrook 7H10培养基和OADC增菌剂均购买于美国BD公司，PAS购买于美国Sigma公司。MTB药敏试验试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司(货号BC8001)。

改良罗氏固体培养基由本实验室配制，配方基础成分(g/600 ml)：磷酸二氢钾2.4 g、硫酸镁0.24 g、柠檬酸镁0.6 g、L-谷氨酸钠7.2 g、孔雀绿0.4 g、马铃薯淀粉30.0 g。基础成分购自北京索莱宝科技有限公司。配制方法：称取基础成分49.84 g，并吸取甘油12 ml，加热搅拌溶解于600 ml蒸馏水中，煮沸5～10 min，121 ℃高压灭菌15 min取出。待冷却至55 ℃左右时，以无菌操作方法加入无菌搅匀的全蛋液1000 ml，混匀(避免产生气泡)，分装18 mm×180 mm 试管，每管7 ml，置于成长斜面，用85～90 ℃流动蒸汽加热1～1.5 h后，取出放冷备用。含PAS的罗氏固体培养基在此基础上，配制时分别加入不同浓度的PAS。WHO推荐的MTB对PAS耐药临界浓度为1.0 mg/L[12]。

二、研究方法

1.体外诱导耐PAS的MTB菌株：采用WHO推荐的改良罗氏固体药敏试验，参照MTB传统药敏试验培养基中PAS浓度，配制一系列的药物浓度梯度，依次将各药物稀释1倍，稀释4个梯度，即得到不同的药物浓度20、2-1、2-2、2-3、2-4。挑取H37Rv单克隆菌株接种于中性罗氏培养基上进行扩大培养，该菌株视为原始初代菌株P0代。随后将该菌株分别接种在不同浓度的PAS培养基上，37 ℃培养4周，其间记录各浓度培养基上菌株的生长状况；4周后挑选生长状态较好的一组进行下一轮传代，所有药物浓度梯度提高1倍。依此类推，筛选出每一代生长良好的菌株，连续传代，直至筛选的阳性克隆株的MIC值达到WHO推荐的PAS耐药临界浓度(1.0 mg/L)。另外，为进一步探索MTB获得高水平PAS耐药的机制，继续给予上述诱导成功的标准菌株21、22、23倍药物浓度压力刺激，保留每一代阳性菌株，从而建立每种药物连续诱导的MTB耐药动态变化模型株，有助于分析MTB药物压力下的遗传进化和耐药机制。

2.筛选耐药水平相似的临床分离株：从本中心的生物样本库中筛选耐药水平相似的PAS耐药临床分离株和PAS敏感临床分离株，并用液体微孔板法进行药敏试验复核。

3.MTB菌株药敏试验：用液体微孔板法检测本研究所用MTB菌株对14种抗结核药物[异烟肼(INH)0.025～4 mg/L、链霉素(Sm)0.25～40 mg/L、乙胺丁醇(EMB)0.31～20 mg/L、氧氟沙星(Ofx)0.25～16 mg/L、莫西沙星(Mfx)0.06～4 mg/L、阿米卡星(Am)0.25～16 mg/L、卡那霉素(Km)0.62～20 mg/L、卷曲霉素(Cm)0.5～16 mg/L、丙硫异烟胺(Pto)0.62～20 mg/L、PAS 0.5～16 mg/L、利福平(RFP)0.25～8 mg/L、利福布汀(Rfb)0.12～4 mg/L、左氧氟沙星(Lfx)0.25～16 mg/L和吡嗪酰胺(PZA)50～900 mg/L]的MIC及交叉耐药情况。

4.MTB基因组DNA提取及测序：取400 μl上述灭活的诱导菌株、临床分离株及作为对照组的H37Rv菌株的菌液进行超声分散。运用十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB)法提取MTB全基因组，并用 NanoDrop 测定浓度,然后用0.8%～1%琼脂糖凝胶电泳检测样品质量。使用Agilent 5400对DNA纯度、浓度、完整性进行检测。DNA样品检测合格后，使用Covaris超声波破碎仪随机打断，再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备工作。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测。插入片段大小符合预期后，使用实时荧光定量PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。文库检测合格后，按照有效浓度及目标下机数据量的需求将不同文库pooling至flowcell，cBOT成簇后使用美国Illumina公司高通量测序平台NovaSeq 6000进行测序。测序数据已上传Sequence Read Archive (SRA)公共数据库，BioProject编号为PRJNA883518和PRJNA883540。

三、数据分析

1.MTB突变分析：(1)低质量序列过滤、接头(adapter)序列去除：测序得到的原始数据(Raw Data)会存在一定比例的低质量数据，为了保证后续信息分析结果的准确可靠，采用Fastq(0.20.0)质控软件对原始数据进行质控，得到有效数据(Clean Data)。(2)参考序列比对：从各样品质控后的有效数据出发，将有效数据比对到MTB参考基因组H37Rv(NC_000962.3)进行测序深度和覆盖度的统计(BWA 0.7.17)。(3)变异检测：通过与参考基因组H37Rv进行比对结果(Bam文件)，鉴定突变位点(Freebayes 1.3.2)，进行变异检测，对突变进行注释(同义、错义、无意、移码突变等)，获得目标基因组对于参考基因组的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)及插入缺失(insertion-deletion，InDel)等一系列变异信息(SnpEff 4.3t)。

2.耐药分析：从突变分析中生成的Bam文件提取各耐药位点的序列比对信息，分析各耐药位点的突变，根据耐药位点数据库(https://github.com/jodyphelan/tbdb)中突变和耐药关系，预测耐药表型。

结 果

一、诱导耐PAS的MTB菌株

采用WHO推荐的改良罗氏固体药敏试验，在体外诱导产生不同耐药水平的PAS耐药菌株，期间保留每一代阳性菌株，建立耐PAS的MTB耐药动态变化模型(图1)。诱导过程中，在第三代，MTB菌株(P3)对PAS出现耐药性，但菌株生长状态较差，连续培养至第七代(P7)，菌落形态与无药对照组相似。然后继续培养三代，稳定耐药性状，至此获得PAS临界耐药的MTB菌株。为进一步探索MTB获得高水平PAS耐药的机制，继续给予上述诱导成功的标准菌株2、4、8倍药物浓度压力，并分别获得对应的耐PAS菌株(P15、P20和P26)。

注 MTB：结核分枝杆菌；PAS：对氨基水杨酸；MIC：最低抑菌浓度图1 体外诱导对氨基水杨酸耐药结核分枝杆菌菌株示意图

二、MTB药敏试验验证耐药表型

用液体微孔板法检测上述诱导菌株对14种抗结核药物的MIC及交叉耐药情况。结果显示，在诱导培养至第三代时即出现PAS耐药，除P1和P2代菌株外，其他代次均出现PAS单一耐药，且耐药水平由低到高依次递增，证明菌株耐药模型诱导成功(表1)。

三、全基因组重测序分析MTB对PAS耐药的遗传进化轨迹

对上述诱导菌株进行全基因组重测序分析，比较耐药菌株与野生型菌株的基因组差异，通过耐药性相关遗传单元特异性分析、突变热点区分析、补偿性突变分析获得与耐药相关的基因组序列位点，如基因内突变、基因间突变等，筛选与耐药相关的基因；通过对所有代次菌株测序，发现PAS耐药可能与3个位点突变直接相关，分别是plcC(Q462R)、folC(S150R)和1个thyA上游位点(3074495G→A)。需要注意的是，诱导过程中，在第三代MTB菌株(P3)获得PAS耐药(MIC为4 mg/L)时，plcC和tlyA上游基因发生突变。至第六代时， MTB菌株(P6)对PAS的MIC上升到8 mg/L，plcC、folC和tlyA上游基因均发生突变。之后至P26，基因组均未在此基础上发生其他突变，但是耐药水平明显提高(表2)。

表2 对实验室诱导结核分枝杆菌菌株进行全基因组测序所得的与PAS耐药相关的基因突变

四、全基因组测序分析耐PAS的MTB临床分离株的基因突变

为进一步分析基因突变与MTB耐PAS的关系，筛选耐药水平相似的PAS耐药临床分离株和PAS敏感的临床分离株，并用液体微孔板法进行药敏试验复核。将所筛选到的MTB菌株分为3类：(1)PAS敏感菌株(617株)；(2)INH和RFP均敏感、PAS耐药的MTB菌株(30株)；(3)INH、RFP和PAS均耐药菌株(72株)。根据流行病学调查数据，发现以上菌株的患者均未使用过PAS进行抗结核治疗。对该719株临床MTB菌株进行全基因组测序，并从突变分析中生成的Bam文件提取各耐药位点的序列比对信息，分析各耐药位点的突变，结合耐药位点数据库中的信息，分析突变和耐药的关系。在617株PAS敏感的MTB菌株中，只发现1株folC基因发生突变(E40G)，6株thyA基因发生突变(H75N)。在30株INH和RFP均敏感、PAS耐药的MTB菌株中，folC和thyA均未发生突变。在72株INH、RFP和PAS均耐药的菌株中，3株folC基因突变，3株thyA突变，2株thyX基因间突变(c.-16 C→T)。鉴于菌株来源的患者并未接受过PAS治疗，表明这些临床株中的folC、thyA和thyX突变并非由PAS引起。

讨 论

MTB耐药机制研究虽然是一个老课题，但是，目前的研究几乎都是利用临床分离的敏感菌株和耐药菌株进行研究。由于菌株的遗传背景不同，各菌株的进化水平有差异，因此，难以获知MTB在体外耐药变化的系统进化过程，进而无法全面、准确地分析其耐药机制。本研究中，为了克服背景基因差异的干扰，笔者采用体外药物浓度梯度诱导法将MTB标准菌株H37Rv逐步诱导成不同耐药水平的耐PAS菌株，建立起PAS耐药菌株模型。所有的耐药菌株均筛选自同一标准菌株，基于相同的遗传背景，耐药菌株新积累的遗传变异很可能与其获得的耐药性相关，大大降低了假阳性突变。而且，与高浓度药物诱导的方法不同，该方法可以更好地模拟药物在体内的积累。

全基因组测序技术已经被广泛用于抗结核药物作用机制的研究中[13-16]。通过对本研究中的实验室诱导产生的耐PAS的MTB菌株进行基因组测序，发现由PAS单一因素影响产生的基因突变非常少，包括plcC(Q462R)、folC(S150R)和1个thyA上游位点(3074495G→A)，其中2个在PAS耐药相关基因中已有报道。有研究者采用高浓度PAS诱导的方法，也产生了许多folC突变的耐药MTB，其中，Ser150的突变也被包括在内[6, 17]。已知folC可通过形成二氢叶酸(H2Pte-Glu)类似物羟基二氢叶酸(H2PtePAS-Glu)来活化PAS。晶体结构显示，folC突变(S150R)所在的四螺旋束(α1-α2/α4-α5)在与羟基二氢蝶酸(H2PtePAS；H2Pte的类似物)的相互作用中起重要作用，表明该突变体可能影响H2PtePAS谷氨酰胺化的效率。Zhang等[7]研究发现，在分离的临床耐PAS的MTB菌株中存在34.8%(72/208)的folC突变，并且5个特定残基(第40、43、49、150和153位)占临床分离株中folC突变体的94.4%(68/72)。本研究在临床耐PAS的MTB菌株中也观察到几种不同的folC突变(E40G和I43T)，但是并未检测到S150R突变。另外，在617株PAS敏感的MTB菌株中，也发现1株folC基因发生突变(E40G)，6株thyA基因发生突变(H75N)。而在30株INH和RFP均敏感、PAS耐药的MTB菌株中，folC和thyA均未发生突变。72株INH、RFP和PAS均耐药的菌株中，3株folC基因突变，3株thyA突变，2株thyX基因间突变(c.-16C>T)。需要注意的是，本研究中临床菌株来源的患者从未接受过PAS抗结核治疗，表明这些临床株中的folC、thyA和thyX突变并非由PAS引起。已有研究显示，PAS耐药与大多数抗结核药物(Sm、INH、RFP、EMB、Lfx和Am)的耐药及结核病的治疗史和临床类型(耐多药或者广泛耐药)明显相关[5, 18]。

还有一点值得思考，在实验室诱导的耐PAS菌株中，plcC和tlyA上游基因发生突变后菌株获得低水平PAS耐药(MIC为4 mg/L)；plcC、folC和tlyA上游基因均发生突变后，菌株耐药水平升至8 mg/L；之后至P26，基因组均未在此基础上发生其他突变，但是耐药水平明显提高，提示thyA上游位点与PAS低水平耐药相关；累积的folC突变与PAS中度耐药相关；除基因突变外，可能存在其他与对PAS高水平耐药发生相关的调控机制。这具有一定的临床意义，说明可通过优化药物剂量[19]等方法来预防和控制更高水平的PAS耐药发生。

综上所述，本研究通过体外药物浓度梯度诱导法构建了动态连续的PAS耐药MTB菌株模型，并通过全基因组测序发现3个与PAS耐药直接相关的突变位点，间接证明除基因突变因素以外，尚存在其他与PAS高水平耐药发生相关的调控机制，值得进一步研究。对PAS敏感和耐药的MTB临床分离株测序发现，某些folC、thyA和thyX突变并非由PAS引起。另外，对全基因组测序所得的与PAS耐药相关的基因突变也需要进一步验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献余美玲：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、文章撰写；张晨晨：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、分析/解释数据；魏文静、赵雨川和卓文基：酝酿和设计实验、文章撰写；郑磊：酝酿和设计实验、文章撰写、工作支持(指导)