2017—2019年福建省结核分枝杆菌分离株基因型特征及其耐药性分析

魏淑贞 赵永 林建 林淑芳 戴志松

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)基因分型常用于结核病分子流行病学研究，在结核病疫情处置中常用其进行溯源分析，并判断是否发生聚集性疫情。间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)是鉴定北京基因型与非北京基因型的金标准，是MTB基因分型主要的方法之一。近年来，国内研发的基于熔解曲线法的新型间隔区寡核苷酸分型(Melted curve Spoligotyping，McSpoligotyping)，相对于传统的Spoligotyping具有操作简便、快速、准确等优势[1]。笔者运用该方法对福建省2017—2019年来源于耐药监测点的477株MTB临床分离株进行快速基因分型，以掌握福建省当前MTB流行情况，了解MTB各基因型与耐药性的关系。

材料和方法

1.菌株来源：选取2017—2019年福建省结核病耐药监测点的477株MTB临床分离株，其中，2017年6株、2018年256株、2019年215株；福州市54株、厦门市33株、宁德市27株、莆田市100株、泉州市143株、龙岩市78株、三明市24株、南平市18株。MTB标准株H37Rv由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供。

2.菌种初步鉴定与药物敏感性试验(简称“药敏试验”)：采用对硝基苯甲酸(PNB)/噻吩-2-羧酸肼(TCH)生长实验法，按照《结核病实验室检验规程》进行菌种初步鉴定，PNB和TCH鉴别培养基中含药浓度分别为500 μg/ml和5 μg/ml。采用传统固体比例法对9种抗结核药物进行药敏试验，含药培养基中各药物浓度分别为：异烟肼(isoniazid，INH)0.2 μg/ml，利福平(rifampin，RFP)40 μg/ml，链霉素(streptomycin，Sm)4 μg/ml，乙胺丁醇(ethambutol，EMB)2 μg/ml，卡那霉素(kanamycin，Km)30 μg/ml，氧氟沙星(ofloxacin，Ofx)4 μg/ml，卷曲霉素(capreomycin，Cm)40 μg/ml，丙硫异烟胺(prothionamide，Pto)40 μg/ml，对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid，PAS)1 μg/ml。若耐药百分比≥1%，则认为受试菌对该药耐药；反之，则认为受试菌对该药敏感。耐药百分比=含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的菌落数×100%。

3.DNA提取：刮取生长2～3周的MTB一菌环置于装有200 μl三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)缓冲液的1.5 ml离心管中，盖好盖子；90 ℃热裂解20 min后平衡至室温。采用核酸提取试剂条(厦门致善生物科技股份有限公司)在Lab-Aid 824 核酸提取仪(厦门致善生物科技股份有限公司)按照说明书的操作步骤进行提取。收集提取好的DNA于高压灭菌后的EP管中，-20 ℃保存备用。

4.McSpoligotyping 分型：每份样品需要扩增3个体系，即McSpoligotyping PCRMixA、MixB、MixC。3个体系的PCR反应液按每份样品需19.75 μl MixA/B/C与0.25 μl酶混合，振荡混匀数秒瞬时离心后，以每管20 μl分装到PCR反应管中。向每个PCR反应管加入5 μl的样品DNA，并以MTB标准株H37Rv的DNA和去离子水作为阳性和阴性对照。再行扩增及熔解曲线分析。扩增条件：50 ℃ 5 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，50个循环。熔解曲线分析：95 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，35～90 ℃以0.04 ℃/s的速率升温，此时采集4个通道FAM、HEX、ROX和CY5的荧光信号。

5.结果判读：实验运行结束后,分析软件自动给出一串43位的二进制码。判读结果的规则如下：(1)优先判读HEX通道的内控熔解峰(44～48 ℃)，若内控熔解峰缺失则判定该样品无效。(2)若对应的熔点范围内有熔解峰，则相应的间隔区存在，表示为“n”；若无熔解峰，则相应的间隔区缺失，表示为“o”。样品分型结果按43个间隔区(SP1、SP2、SP3…SP43)的顺序以“n”和“o”形式表示。

6.数据整理：McSpoligotyping检测结果提交至SpolDB 4.0数据库(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT2/)，得到每个菌株的SIT编号和所属基因家族，再上传至国际数据库MIRU-VNTRplus(https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces)进行比对分析。

7.统计学处理：采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，计数资料以“构成比/百分率(%)”描述，组间差异的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。运用BioNumericsSoftware 5.10 对分型结果进行聚类分析，生成最小生成树图。

结 果

1.McSpoligotyping分型结果：北京基因型有245株，占51.4%；T家族有44株(含2株T，28株T1，7株T2，T3和T4各3株，1株T5)，占9.2%；H家族有35株(含13株H，1株H1，21株H3)，占7.3%；EAI家族有11株(含10株EAI2-Manila，1株 EAI5)，占2.3%；LAM3、Manu2和X1家族各有1株，分别占0.2%；所属家族未定义或不明确的有139株，占29.1%。477株菌株的分离地均是北京基因型所占的比例最高，为主要流行型，见表1。

2.聚类分析与主要流行基因型：共检出204种基因型别，发现其中有146个新的型别(在SpolDB 4.0中无对应的SIT编号)，所有基因型主要归为7个家族(北京、T、H、LAM、EAI、Manu、X)和未定义家族。聚类分析结果见图1。可分为137个独立基因型和34个基因簇，每个簇包含2株及以上，其中，最大的一个簇为北京基因型(含216株)，成簇的菌株共有340株，菌株成簇率为71.28%(340/477)。各基因型家族主要流行型为北京家族的SIT1(44.9%，214/477)、T家族的SIT53(2.5%，12/477)、H家族的SIT742(1.9%，9/477)、EAI家族的SIT19(1.5%，7/477)。

注 圈的大小代表菌株数量的多少图1 福建省477株结核分枝杆菌临床分离株基因型聚类分析

3.MTB基因型与耐药性的关系：对477株临床分离菌株进行一线抗结核药物耐药性检测，结果显示，不同基因家族的菌株对EMB、Sm耐药率之间的差异均无统计学意义；对INH、RFP 耐药率之间的差异均有统计学意义。进行二线抗结核药物耐药性检测结果显示，不同基因家族菌株对Km、Cm和Pto耐药率之间的差异均无统计学意义；对Ofx和PAS耐药率之间的差异均有统计学意义，H家族基因型菌株对Ofx耐药率高于其他基因家族菌株，未定义家族菌株对PAS耐药率高于其他基因家族菌株。具体见表2。

表2 不同抗结核药物敏感性在各基因家族结核分枝杆菌临床分离株的分布情况 [株(构成比，%)]

讨 论

Spoligotyping分型是结核病分子流行病学研究重要的分析手段。传统的检测方法是基于普通的PCR方法进行间隔区序列的扩增，扩增产物与固定在杂交膜上的43条探针杂交，其底物经过链亲和素碱性磷酸酶酶促分解为发光物质，再通过化学发光增强剂的作用后，在暗室里经X光曝光一定时间，然后显影和定影，根据X光胶片上的杂交信号有无，由人工判读相应的间隔区是否存在，再以43位二进制数字上传到国际数据库分析其样本对应的基因型。传统的方法操作繁琐，耗时长(约6～8 h)，需人工判读结果。McSpoligotyping分型操作简便，仅需3 h完成检测，结果自动化判读，且PCR产物后处理无需开盖操作[1-4]。据文献报道，McSpoligotyping与传统的Spoligotyping方法检测结果一致性高达97.71%[1]，与全基因组测序的一致性达94.18%[2]。由此可见，McSpoligotyping可替代传统的Spoligotyping方法用于结核病的基因分型研究。

北京基因型是世界各地特别是东南亚地区MTB致病菌中流行最广泛的基因型[5]。本研究结果显示，福建省北京基因型MTB菌株的分离率为51.4%，低于青海、陕西、北京、江苏等地区报道的73.71%～86.21%[6-9]，与贵州省(49.1%)相持平[10]，略低于海南的57.6%[11]、广西的56.95%[12]、云南的55.72%[13]，进一步反映了北京基因型MTB菌株在我国的分布呈现北高南低的特征。本研究结果进一步说明了北京基因型MTB菌株，特别是其中的SIT1型，是福建省MTB的主要流行株。

本研究结果显示，除了北京家族基因型，福建省流行排在前3位的MTB基因型家族为T家族、H家族、EAI家族，与福州[14]和厦门[15]地区的主要流行菌株情况基本一致。MTB基因型T家族和H家族是欧美地区主要的流行家族，EAI主要流行于亚洲地区的印度、菲律宾和越南等地区。本次研究中，T、H、EAI、LAM等不同基因家族的MTB菌株主要分离自泉州、莆田、宁德等沿海地区，推测这些家族菌株之所以在省内流行可能与福建省重要的地理位置及历史文化有关。福建省是海上丝绸之路的发祥地，在中国不同历史时期的海上丝绸之路扮演重要角色，与欧美和东南亚国家经济贸易频繁，人口流动性大。除T、H、LAM、EAI、Manu、X家族外，本研究还发现了146个新的Spoligotype基因型，其中135个基因型的家族未定义，4个基因型的家族不明确，在本研究中归属于未定义家族。这反映了福建省MTB具有丰富的遗传多样性，有利于研究其基因家族的流行传播和进化。今后的工作中应加强对MTB这些基因家族的监测和研究。

北京家族基因型MTB菌株是我国主要的流行株[5]。MTB菌株各基因型与其耐药性之间的关系一直备受关注。本研究结果显示，各基因家族MTB菌株与INH、RFP的耐药性有关，而与EMB、Sm的耐药性无关。这与国内其他地区如广东[16]和江苏[9]报道的结果一致。本研究显示，各基因型家族MTB菌株对Km、Cm和Pto的耐药率之间的差异无统计学意义，H家族菌株对Ofx耐药率高于其他基因家族菌株，与梁晨等[7]报道的非北京基因型MTB菌株对左氧氟沙星的耐药率高于北京基因型菌株相类似，进一步提示了不同基因型家族MTB菌株对氟喹诺酮类药物的耐药性之间存在差异，对于耐药结核病患者，及时检测氟喹诺酮类药物的耐药性对患者临床上合理有效用药具有一定的指导意义。

本研究存在以下不足：一是未将福建省2017—2019年全省监测点的菌株全部纳入分型，2017年的菌株纳入数量很少，未能全面展示全省MTB的基因型，也未能分析3年内MTB流行基因型的变化趋势。二是研究的菌株对二线抗结核药物耐药的菌株数少，今后需进一步增加样本量进行分析。三是McSpoligotyping的分辨力相对较低，未分析来源成簇菌株患者之间的流行病学关联。

志谢感谢中国疾病预防控制中心传染病预防控制所刘海灿博士对基因分型结果的复核与聚类分析。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献魏淑贞：实验设计与检测、论文撰写、资料分析；赵永和林建：实验检测与资料收集；林淑芳：行政/技术/材料支持、指导；戴志松：行政/资料支持、指导、研究经费支持、论文修改指导