响应面优化菌草灵芝水提物提取工艺及其纳米乳制备技术

谢 晶, 孙连月, 周童晖, 卜建超, 方锦涛, 张皓珊, 何 菲, 李 晶, 林占熺

(1.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002；2.湖南人文科技学院农业与生物技术学院，湖南 娄底 417000；3.福建商学院，福建 福州 350012；4.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002)

灵芝(Ganodermalucidum)为真菌门多孔菌目灵芝菌科灵芝属的一种大型木腐真菌子实体，在我国古代被誉为仙草、瑞草，《神农本草经》[1]将其列为十大名药之首.菌草灵芝是指用菌草代替木屑、椴木栽培的灵芝[2].用菌草栽培灵芝不仅可降低成本[3]，还能解决“菌林矛盾”，菌草灵芝活性有效物的含量、药用价值均高于木屑栽培的灵芝[4]，其中多糖的含量为椴木灵芝的2 倍以上[5].

灵芝水提物精粉是将灵芝子实体经热水浸提、浓缩、干燥得到的灵芝浸膏粉[6].研究发现，灵芝水提物具有增强免疫力[7]、抗肿瘤[8]、保护神经元[9]、降血糖[10]、美白以及抗衰老[11]等作用.由于灵芝水提物精粉采用热水浸提法，无任何有机溶剂残留的风险，能被广泛应用于食品、药品、化妆品上.目前，大量的研究集中在灵芝活性成分(如多糖)提取、分析和鉴定以及活性成分的功能方面，而与灵芝水提物提取工艺相关的报道较少.

灵芝水提物中含有大量活性成分，因此，在后期贮存和应用中会受到氧、温度等影响，导致其活性降低；而纳米乳粒径较小，属于热力学上的稳定胶体分散体系，能作为灵芝水提物中活性物质的有效载体，达到不同成分间协同作用的效果[12].研究表明，复方人参皂苷纳米乳能增强小鼠的细胞免疫和体液免疫功能[13]；经鼻复方丹参纳米乳原位凝胶与普通原位凝胶相比，对脑血管的脑靶向效率更高，且制备方法简单，剂型稳定安全[14]；复方丹皮酚纳米乳可抑制肺癌细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞和凋亡[15].目前，纳米乳的制备方法有借助高速剪切、高压均质、超声波等机械力的高能乳化法，也有通过相变温度法促进乳化的方法，还有在水包油乳化体系中常使用的相变法.后两种方法属于低能乳化法，是食品、医药、化妆品等领域制备纳米乳的重要方法[16-18].但利用灵芝水提物制备纳米乳的研究较少.

本研究以菌草灵芝为研究对象，通过单因素试验、Plackett-Burman设计和Box-Behnken响应面分析法优化菌草灵芝水提物的提取工艺，并采用伪三元相图法筛选菌草灵芝精粉纳米乳的最佳制备条件，旨在提高菌草灵芝水提物的提取效率和利用效率，为菌草灵芝产品的开发和应用提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌草鹿角灵芝切片由福建农林大学国家菌草工程技术研究中心提供；大豆油、玉米油、橄榄油由中国粮油集团有限公司生产；Tween80和Span80由广东润华化工有限公司生产；丙三醇(甘油)由美国陶氏集团生产.

电热恒温水槽(DHG-9240A，上海精宏实验设备有限公司)，旋转蒸发仪(R206D，上海申生科技有限公司)，高速台式冷冻离心机(5415R，德国Eppendorf公司)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9240A，上海精宏实验设备有限公司)，电子天平[BSA124A，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]，激光粒度仪(ZS90，英高马尔文仪器有限公司)，透射电镜(HT7700，日本HITACHI公司).

1.2 方法

1.2.2 菌草灵芝水提物得率测定 菌草灵芝水提物得率(Y)/%=m1/m×100.式中：m1为恒重后菌草灵芝精粉的质量，m为菌草灵芝切片的质量.

1.2.3 菌草灵芝水提物提取单因素试验设计 在固定液料比(20∶1)、提取温度(90 ℃)、提取时间(2 h)、旋转蒸发转速(40 r·min-1)、离心转速(8 000 r·min-1)、离心时间(15 min)其中5个因素的条件下，分别考察液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)、提取温度(60、70、80、90、100 ℃)、提取时间(1、2、3、4、5 h)、旋转蒸发转速(30、40、50、60、70 r·min-1)、离心转速(6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 r·min-1)、离心时间(5、10、15、20、25 min)6个因素对菌草灵芝水提物得率的影响.每组试验重复3次.

1.2.4 Plackett-Burman试验设计 在单因素试验的基础上，以因素X1、X2、X3、X4、X5、X6分别代表液料比、提取温度、提取时间、旋转蒸发转速、离心转速、离心时间，每个因素取2个水平，高水平赋值为+1，低水平赋值为-1(表1)，测定影响得率(Y)的关键因素.

表1 Plackett-Burman试验6个因素水平设计Table 1 Level design of 6 factors in Plackett-Burman experiment

表2 Box-Behnken响应面试验3个因素水平设计Table 2 Level design of 3 factors in Box-Behnken experiment

1.2.5 Box-Behnken响应面试验 根据Plackett-Burman试验的结果，选择X1、X2、X3为自变量，以Y为响应值进行试验设计，见表2.

1.2.6 伪三元相图法制备菌草灵芝精粉纳米乳 (1)伪三元相图的绘制.按照混合表面活性剂与油相1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例制备混合物，称取混合物于烧杯中，再缓慢滴加去离子水，溶液由澄清变浑浊，再变澄清，记录混合表面活性剂、油相、水相达到相转变临界点时的质量分数，将其作为三元相图的3个顶点，利用Origin软件绘制伪三元相图，以形成的乳区范围确定纳米乳的配方[20].

(2)表面活性剂配比的筛选.以亲水亲油平衡(hydrophilic lipophilic balance， HLB)值为指标，按照水包油(O/W)型纳米乳筛选表面活性剂配比.选用 Tween80(HLB值=15)和Span80(HLB值=4.3)复配作为表面活性剂，分别将Tween80与Span80按质量比2∶1、3∶1、4∶1进行混合，助表面活性剂为丙三醇，大豆油为油相，表面活性剂与助表面活性剂质量比为3∶1，0.5%菌草灵芝精粉溶液为水相，搅拌至形成透明的纳米乳剂，绘制伪三元相图.

(3)油相的筛选.设置Tween80与Span80质量比为3∶1，表面活性剂与助表面活性剂质量比为3∶1，选用玉米油、大豆油、橄榄油作为油相，0.5%菌草灵芝精粉溶液为水相，搅拌至形成透明的纳米乳剂，绘制伪三元相图.

(4)表面活性剂和助表面活性剂质量比的筛选.设置Tween80与Span80质量比为3∶1，大豆油为油相，分别将表面活性剂与助表面活性剂按质量比2∶1、3∶1、4∶1进行混合，0.5%菌草灵芝精粉溶液为水相，搅拌至形成透明的纳米乳剂，绘制伪三元相图.

(5)水相的筛选.设置Tween80与Span80质量比为3∶1，表面活性剂与助表面活性剂质量比为3∶1，大豆油为油相，分别加入质量分数为0.1%、0.5%、1.0%的菌草灵芝精粉溶液，搅拌至形成透明的纳米乳剂，绘制伪三元相图.

1.2.7 菌草灵芝精粉纳米乳粒径测定及形态考察 取制备好的菌草灵芝精粉纳米乳1 mL，用水稀释100倍，用激光粒度仪测定纳米乳粒径、zeta电位，重复测定3次并取其均值[21].

将铜网置于封口膜上，滴加适量纳米乳，之后用磷钨酸液(ω=2%)滴在封口膜上，再将铜网倒覆于染液上负染15 min后用蒸馏水冲洗，吸干水分，用透射电镜观察纳米乳形态[21].

1.3 数据分析

运用Excel 2016软件对单因素试验数据进行统计与分析；用Mintab 17.0软件进行Plackett-Burman试验设计与结果分析；用Design-Expert 11软件对Box-Behnken试验结果进行分析和绘图.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

液料比对菌草灵芝水提物得率的影响如图1A所示，随着液料比的增加，菌草灵芝水提物得率呈先增大后减小的趋势.当液料比为25∶1时，得率达到最大值(10.90%)；之后随着液料比继续增大，得率下降，说明在保持提取温度和时间不变的情况下，过多的液料会使物料的扩散和溶出率降低，这与宋智琴等[22]对石斛多糖提取工艺的优化结果一致.因此，暂定最适液料比为25∶1.

图1 液料比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)、旋转蒸发转速(D)、离心转速(E)、离心时间(F)对灵芝水提物得率的影响Fig.1 Effects of liquid-material ratio (A), extraction temperature (B), extraction time (C), rotary evaporation speed (D), centrifugal speed (E), and centrifugal time (F) on yield of G.lucidum water extract

提取温度对菌草灵芝水提物得率的影响如图1B所示，随着提取温度的升高，菌草灵芝水提物得率大体呈先增大后减小的趋势.当提取温度为90 ℃时，得率达到9.00%；但当温度为100 ℃时得率明显降低，这是因为温度过高使分子扩散运动过于激烈，不利于物料的溶出.因此，暂定最适提取温度为90 ℃.

提取时间对菌草灵芝水提物得率的影响如图1C所示.随着提取时间的延长，菌草灵芝水提物得率开始快速增大，当提取时间为3 h时，得率为8.75%；之后增加缓慢并趋于稳定，这表明菌草灵芝中能够溶解在水中的物质在3 h时基本被提取完全.刘复容等[23]用索氏抽提法对黑水虻幼虫粗油脂进行提取时，也发现提取到一定时间，提取率不再随着时间的延长而增大.因此，暂定最适提取时间为3 h.

旋转蒸发转速对菌草灵芝水提物得率的影响如图1D所示，随着旋转蒸发转速的增大，菌草灵芝水提物得率呈现先增大后减小的趋势.当转速为50 r·min-1时，得率最大，达9.03%；之后随着转速继续增大，得率有所降低，这可能是因为过快的旋转蒸发转速降低了物料粗提液与旋蒸仪导热装置的表面接触，从而影响了其得率.因此，暂定最适旋转蒸发转速为50 r·min-1.

离心转速对菌草灵芝水提物得率的影响如图1E所示，随着离心转速的增大，菌草灵芝水提物得率呈现先增大后减小的趋势.当离心转速为9 000 r·min-1时，得率达到8.73%；之后随着离心转速继续增大，得率降低，这可能是因为菌草灵芝水提物中含有一定比例的小分子物质，过高的离心转速会导致小分子物质无法沉降.这个现象与李伟民等[24]对山药蛋白提取的研究结果较为一致.因此，暂定最适离心转速为9 000 r·min-1.

离心时间对菌草灵芝水提物得率的影响如图1F所示，随着离心时间的延长，菌草灵芝水提物得率呈先增大后减小的趋势.当离心时间为15 min时，得率最大(8.99%)，之后得率逐渐降低.董亮等[25]以云南普洱茶为研究对象提取茶多糖时也发现了相似的规律.因此，暂定最适离心时间为15 min.

2.2 Plackett-Burman试验结果

Plackett-Burman试验设计和结果如表3-4所示.经数据分析得知，6个因素对菌草灵芝水提物得率的影响大小表现为X1>X2>X3>X5>X4>X6，其中，具有显著影响(P<0.05)的因素为X1和X2.结合单因素试验数据，选取X1、X2、X3作为Box-Behnken响应面优化试验的考察对象.

表3 Plackett-Burman试验设计与结果Table 3 Plackett-Burman experiment design and result

表4 Plackett-Burman试验结果方差分析1)Table 4 ANOVA analysis of Plackett-Burman test

2.3 Box-Behnken响应面优化结果

2.3.1 响应面试验结果 Box-Behnken试验设计和结果见表5.

不同因素的交互作用对菌草灵芝水提物得率的影响见图2.响应曲面的坡度越陡，反映试验因素对得率的影响越大；坡度越平缓，反映其影响程度越小.

由图2A可知：当提取时间一定时，随着液料比的增加，菌草灵芝水提物得率逐渐升高，且曲线坡度较陡；随着提取温度的升高，菌草灵芝水提物得率先升高后降低，且曲线坡度陡峭.这说明两者交互作用对菌草灵芝水提物得率有较大影响.

由图2B可知，当提取温度一定时，液料比与提取时间交互作用的影响不显著.随着液料比的增加，菌草灵芝水提物得率先升高后缓慢降低，且曲线坡度较陡；随着提取时间的延长，菌草灵芝水提物得率变化不明显，曲线坡度平缓.

由图2C可知，当液料比一定时，提取温度与提取时间交互作用的影响不显著.随着提取温度的升高，菌草灵芝水提物得率先升高后降低，曲线坡度较陡；随着提取时间的延长，菌草灵芝水提物得率变化不大，曲线坡度平缓.

表5 Box-Behnken响应面优化设计与结果(n=3)Table 5 Box-Behnken response surface optimization design and result (n=3)

表6 Box-Behnken响应面优化结果方差分析1)Table 6 ANOVA analysis of Box-Behnken response surface optimization result

图2 液料比、提取温度和提取时间对菌草灵芝水提物得率影响的响应面图Fig.2 Response surface diagram of influence of liquid-material ratio, extraction temperature and extraction time on yield of G.lucidum water extract

根据所建立的模型得到菌草灵芝水提物最佳提取工艺条件为液料比27.004∶1、提取温度93.856 1 ℃、提取时间3.014 52 h，此时菌草灵芝水提物得率理论值为13.94%.

2.3.2 响应面优化条件的验证 结合实际可行性，经修正得到菌草灵芝水提物最适提取工艺条件为液料比27∶1、提取温度93 ℃、提取时间3 h，且设定旋转蒸发转速50 r·min-1、离心转速9 000 r·min-1、离心时间15 min，在此条件下进行3次平行试验并取其平均值，得到菌草灵芝水提物平均得率为13.53%，相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)=0.92%(n=3)，与理论预测值(13.94%)基本一致.因此，采用响应面法对菌草灵芝水提物提取工艺有较好的优化效果.

2.4 菌草灵芝精粉纳米乳制备

2.4.1 表面活性剂配比的筛选 伪三元相图中乳液形成的区域越大，表明乳化效果越好.从图3可看出，当表面活性剂Tween80与Span80质量比为4∶1(此时HLB值为12.8)时，所形成的菌草灵芝精粉纳米乳区的面积最大.这可能是由于较高的HLB值(8～18)更易形成水包油型纳米乳，且表面活性剂最适复配比例，能让其更好地在油相周围生成薄膜，强化两相间的界面以保持乳滴的稳定性.这一结果与包睿文[12]采用香菇多糖制备纳米乳的研究结果类似.因此，本试验选择Tween80与Span80质量比为4∶1.

A.2∶1;B.3∶1;C.4∶1.图3 Tween80与Span80质量比对纳米乳体系形成的影响Fig.3 Influence of mass ratio of Tween80 and Span80 on formation of nanoemulsion system

2.4.2 油相的筛选 如图4所示，当油相为玉米油、橄榄油、大豆油时，所形成的菌草灵芝精粉纳米乳区面积差异较小.但在纳米乳制作过程中，由于大豆油黏度低，其脂肪酸以油酸和亚油酸为主，尤其是亚油酸含量较高[26-28]，这些都有益于纳米乳液的形成[29].因此，本试验选择油相为大豆油.

A.玉米油;B.橄榄油;C.大豆油.图4 油相对纳米乳体系形成的影响Fig.4 Influence of oil phase on formation of nanoemulsion system

2.4.3 表面活性剂与助表面活性剂质量比的筛选 如图5所示，当表面活性剂与助表面活性剂质量比为2∶1时，所形成的菌草灵芝精粉纳米乳区面积较大.这是由于助表面活性剂丙三醇具有较高的黏度，当表面活性剂和助表面活性剂达到一定比例时，能在乳液体系中形成层状结构，降低水油两相间的表面张力，使得整个纳米乳体系稳定.这与蓝苑元等[30]对姜黄素进行乳化的研究结果一致.因此，本试验选择表面活性剂与助表面活性剂质量比为2∶1.

A.2∶1;B.3∶1;C.4∶1.图5 表面活性剂与助表面活性剂质量比对纳米乳体系形成的影响Fig.5 Influence of mass ratio of surfactant and cosurfactant on formation of nanoemulsion system

2.4.4 水相的筛选 如图6所示，随着菌草灵芝精粉浓度的升高，所形成的菌草灵芝精粉纳米乳区面积呈先增大后减小的趋势，这是由于菌草灵芝精粉溶液中含有大量的灵芝多糖，其具有一定黏度，当浓度过高时，多糖分子间可能发生凝胶化作用，导致纳米乳区面积减小.因此，本试验选择0.5%菌草灵芝精粉溶液为水相.

A.0.1%；B.0.5%;C.1.0%.图6 菌草灵芝精粉溶液浓度对纳米乳体系形成的影响Fig.6 Influence of concentration of JUNCAO G.lucidum refined powder solution on formation of nanoemulsion system

2.5 菌草灵芝精粉纳米乳的粒径及其形态

图7所示为菌草灵芝精粉纳米乳在激光粒度仪下的测试结果.由图可知，纳米乳经3次测试的结果均呈单峰型，峰值分别为143.5、154.2、157.8 nm，表明粒径大小均匀，平均粒径为151.8 nm. zeta 电位为-21.29 mV，表明该纳米乳呈负电性，又因其绝对值较大，由同性相斥原理可推测该纳米乳稳定性较好.从图8可以看出，菌草灵芝精粉纳米乳的乳滴为球形，大小为50～200 nm，颗粒较为均匀.可见，电镜观察结果和粒度仪测定结果基本一致.

图7 菌草灵芝精粉粒径分布Fig.7 Distribution of particle size of JUNCAO G.lucidum

3 讨论与结论

图8 透射电镜下菌草灵芝精粉纳米乳形态Fig.8 Morphology of nanoemulsion of G.lucidum refined powder under transmission electron microscope

菌草灵芝精粉采用热水浸提法制备，具有无溶剂残留、工艺简单、有效活性物质含量多的特点.陈灶鑫等[31]通过红外光谱法研究发现，灵芝经不同处理得到的提取物中，承载化学信息量最丰富的提取物为灵芝水提物，其具有抗氧化、美白、抗肿瘤等多种生物活性.近年来，随着人们健康意识的增强，灵芝产品需求量日益增大，若能通过优化提取工艺提高活性物质提取效率，则可以降低生产成本，扩大菌草灵芝相关产品的应用范围.

响应面法具有试验次数合理、试验结果精确、周期短等技术特点，广泛应用于生物工程、食品工艺及药学等领域.王会宾等[32]采用响应面法优化热水浸提灵芝孢子多糖的工艺，田淑雨等[33]采用响应面法优化超声破碎辅助提取灵芝多糖的工艺，刘晓艳等[34]采用响应面法优化灵芝总三萜酶辅助提取工艺，赵立娜等[4]采用响应面法优化菌草灵芝多肽-硒螯合物的制备工艺，均取得了较好的效果.本研究采用Plackett-Burman设计联合Box-Behnken响应面法考察了液料比、提取时间、提取温度、旋转蒸发转速、离心转速、离心时间对菌草灵芝水提物得率的影响.试验得到的最佳工艺条件为液料比27∶1、提取温度93 ℃、提取时间3 h、旋转蒸发转速50 r·min-1、离心转速9 000 r·min-1、离心时间15 min，在此条件下菌草灵芝水提物得率为13.53%.

田艳[35]研究表明，灵芝多糖纳米乳佐剂具有增强疫苗免疫效果的作用；杨迪等[36]研究证实，南极磷虾油灵芝孢子油纳米乳复合物可以提高小鼠免疫力.这些研究显示纳米乳可以提高大分子活性物质的生物效价.因此,本研究将菌草灵芝精粉制成菌草灵芝精粉纳米乳，通过伪三元相图法获得纳米乳最佳制备条件：Tween80与Span80质量比4∶1，大豆油为油相，表面活性剂与助表面活性剂质量比2∶1，0.5%菌草灵芝精粉溶液为水相，该条件下制备得到的纳米乳平均粒径为151.8 nm，zeta电位为-21.29 mV，纳米乳液乳滴为球形，大小均匀.但该纳米乳的活性有待进一步研究.