一株耐盐碱细菌的筛选鉴定及其对植物的促生作用

吕正阳, 邵登科, 张春源, 赖泽成, 李望豪, 周瑞鹏, 刘梓烨, 王荣波, 林占熺, 鲁国东,5, 叶文雨

[1.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002；2.福建农林大学生命科学学院，植物与微生物相互作用福建省高校重点实验室，福建 福州 350002；3.福建农林大学未来技术学院 (海峡联合研究院)，福建 福州 350002；4.福建省作物有害生物监测与治理重点实验室，福建 福州 350013；5.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002]

土壤盐碱化是世界旱作农区突出的生态环境问题[1].据统计，盐碱土资源遍及世界100多个国家，总面积约达10亿hm2[2].我国现有盐碱地面积高达 9.9×106hm2，这些盐碱地中具有农业发展潜力的占我国耕地总面积的10%以上，是我国优良的土地储备资源，如果不加以改良利用，会造成极大的资源浪费[3].土壤盐分的增加是一种破坏性的非生物胁迫，抑制了植物的正常生长和发育，导致农业产量大幅下降，破坏了自然地区的生态平衡[4-6].盐胁迫的存在会导致植物产生离子毒害和渗透胁迫，引起植物氧化损伤，增强土传病原菌的侵染能力[7]，严重影响农业生产效益、危害环境安全.因此，对土壤盐碱化的治理迫在眉睫.

我国盐碱地治理方法主要分为工程法、化学法、生物法，其中，生物法治理盐碱地的成本较低、生态安全性好，具有良好的生态效益并能够长期改良盐碱土壤[8].巨菌草(CenchrusfungigraminusZ. X. Lin & D.M. Lin & S. R. Lan sp. nov.)原产于非洲，为禾本科(Gramineae)蒺藜草属(CenchrusL.)植物，其根系发达、抗逆性强，年产鲜草可达200～400 t·hm-2，巨菌草目前已被作为优质饲料、生物燃料等，在农牧业生产和生态环境改良上被广泛应用[9-11].巨菌草在盐渍地的生物量大且根系发达，有利于固定土壤，且对沙质化盐渍地改良效果较好，土质化盐渍地改良效果相对一般，对盐渍化土壤的改良起重要作用[12-13]，并且已经初步应用于盐碱地的治理[14].玉米是我国三大粮食作物之一，与巨菌草同属于禾本科，属于盐敏感作物，土壤盐渍化严重危害玉米产量[15].植物根际促生菌是指通过自身生命活动，直接或间接促进植物生长的微生物[16]，如假单胞菌(Pseudomonas)[17]、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[18]等.此外，一些根际微生物还能够增强植物抗逆境生长能力，抑制有害微生物生长繁殖，不仅对植物体、自然环境无害，而且许多根际促生菌还有参与植物自身代谢活动和改善生态环境的功能[19-20]，具有良好的研究和应用价值.

本试验从福建莆田盐碱地中分离、筛选出1株耐盐碱能力最强的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)PT6-1，对其生理生化特性以及其对巨菌草、玉米耐盐碱性和抗氧化酶活性等相关指标的影响进行试验探究，为应用耐盐碱微生物与巨菌草联合治理盐碱地，增强农作物的耐盐碱生长能力提供材料.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土壤、菌株、植物材料等 供试土壤：2021年5月采集福建省莆田市秀屿区安柄村3年生火龙果地15～20 cm根际盐碱土壤，装于无菌密封袋，带回实验室立即处理.供试菌株：PT6-1，分离保存于福建农林大学植物与微生物相互作用福建省高校重点实验室.巨菌草幼苗：采集自福建农林大学后山菌草基地.玉米种子：中玉九号，购自吉林省春城种业有限公司.

1.1.2 培养基 细菌生长培养基：LB培养基[21]；生理生化特性测定培养基：CAS检测培养基(铁载体)[21]、蒙娜金有机磷培养基[21]、无机磷培养基[21]、Ashby无氮培养基[21]、淀粉水解培养基[21]、脱脂乳粉培养基[21]、解硅酸盐培养基[21]、明胶液化培养基[21]、CMC培养基(纤维素酶)[22]、King发酵培养基[23].

1.2 方法

1.2.1 耐盐碱细菌的分离、保藏及耐盐碱能力筛选 准确称取5 g土壤样品与45 mL无菌水混匀置于三角瓶内，37 ℃摇床振荡0.5 h，冰浴30 min，取上清液1 mL，用无菌水梯度稀释至10-4、10-5，取100 μL上清稀释液涂布于NaCl浓度为5%、pH值为9(NaOH调节)的耐盐碱能力筛选LB平板，37 ℃黑暗恒温倒置培养48 h，尽可能挑取菌落外观形态不同的细菌单菌落，划线在新的耐盐碱筛选平板上，连续划线纯化3次后保藏[21].用不同浓度NaCl作为单一盐胁迫处理、NaOH调节不同pH值作为单一碱胁迫处理，配制不同的LB液体筛选培养基，以1%的接种量接种细菌菌液，37 ℃，200 r·min-1培养36 h，每隔3 h测定1次培养液在600 nm处的光密度(D600 nm)的吸光度.通过菌株生长情况判断其是否能够耐受当前浓度的盐、碱胁迫.筛选出耐盐、耐碱能力最强的菌株，绘制其在常规LB培养基、含PT6-1可耐受的最高浓度NaCl的LB培养基、可耐受最高pH值的LB培养基内培养的生长曲线.

1.2.2 PT6-1的分子鉴定 以细菌16S rRNA通用引物27F、1492R对筛选出的耐盐碱细菌PT6-1的16S rRNA进行扩增[21]，经琼脂糖凝胶电泳验证，将正确的条带送至擎科生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI的GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行Blast序列对比，下载高同源性序列，采用MEGA X软件，邻近相接法构建系统发育树.

1.2.3 PT6-1生理生化特性 测定PT6-1解有机磷[21]、无机磷[21]、解硅酸盐[21]、固氮[21]、产IAA[23]、产铁载体[21]、明胶液化[21]、产淀粉水解酶[21]、产蛋白酶[21]、产纤维素酶[22]、产接触酶能力[22]的有无，对产生透明圈的平板进行透明圈直径(D)和菌落直径(d)测量，计算溶解比(D·d-1)，固氮酶活性测定用细菌固氮酶ELISA检测试剂盒(上海优选生物科技有限公司).利用革兰氏染色试剂盒(购自索莱宝生物科技有限公司)对其进行革兰氏染色[24]，光学显微镜观察染色结果.

1.2.4 PT6-1对巨菌草、玉米在盐碱条件下生长的促进效果 将NaCl以0.3%的比例添加至植物营养土，用自来水和适量NaOH混合后加入土壤，使土壤含水量为40%～50%、pH 值为8.5～9.0，模拟自然条件下的重度盐碱地.巨菌草幼苗、玉米幼苗在未施加盐碱胁迫的营养土中培育，待幼苗培育至出芽第7天(株高约8～12 cm)，将幼苗移栽入试验盐碱土盆中进行下一步操作.

取出苗约7 d、生长状况相近的巨菌草幼苗(苗高约为8～12 cm)，移栽至盐碱胁迫营养土中， 3株苗1盆，共6盆，其中3盆为对照组(CK)，3盆为PT6-1菌液灌根处理组.移栽后当天进行第1次灌根，每盆的灌根量为20 mLD600 nm=1.0的PT6-1菌液，用自来水稀释10倍进行浇灌，对照组浇灌20 mL LB液体培养基，用10倍自来水稀释.每隔7 d重复进行1次灌根处理，从幼苗移栽当日开始计时，待幼苗生长第28天收获并测定其每盆植株的株高、茎粗、总鲜质量、地上鲜质量、地下鲜质量、总干质量、地上干质量、地下干质量，玉米的处理方式和测定指标与巨菌草相同(移栽日玉米幼苗株高约10～15 cm).

1.2.5 PT6-1对巨菌草、玉米在盐碱胁迫下光合色素含量、抗氧化酶活性的影响 巨菌草、玉米种植，菌液灌根处理方法同1.2.4，取第1次菌液处理后生长第28天的巨菌草、玉米植株，每个处理及对照随机取3株进行测定，测定叶片的总光合色素含量、叶绿素含量，叶片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、根系过氧化物酶(peroxidase，POD)活性和叶片过氧化氢酶(catalase，CAT)活性，试验重复3次[25].

2 结果与分析

2.1 耐盐碱细菌的分离、筛选

分离、筛选出1株耐盐碱能力最强的细菌， 将它命名为PT6-1，其耐NaCl 最高浓度为2.4 mol·L-1，最高耐碱pH值为12.PT6-1在pH值为12的LB液体培养基和NaCl浓度为2.4 mol·L-1的LB液体培养基中均能正常传代培育，但相较于常规LB液体培养基其延滞期增长(图1).

2.2 PT6-1的分子鉴定

对PT6-1进行菌液PCR后经琼脂糖凝胶电泳检测(图2)，PT6-1的16S rRNA片段约1 600 bp.根据测序结果在NCBI网站的Blast下载相似序列，MEGA X软件邻接法建树(图3)，结合其菌落平板形态，鉴定PT6-1为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens).

2.3 PT6-1生理生化特性

PT6-1在LB平板上菌落呈白色，菌落不透明且黏性较强(图4A)；PT6-1为革兰氏阳性菌，经革兰氏染色后显微镜下菌体呈蓝紫色，短杆状(图4B)，符合解淀粉芽孢杆菌的形态特征.PT6-1利用无机磷、解硅酸盐、固氮、淀粉水解、蛋白水解、产铁载体、产纤维素酶、产接触酶等能力呈阳性(图4C-4J)，固氮酶活性为(179.77±4.62) U·L-1.其余测定指标：解有机磷能力、明胶液化能力、吲哚物质产生能力为阴性.产生、利用效率(溶解比)=(透明圈直径D)/(菌落直径d)，PT6-1在解蛋白、解淀粉、解无机磷、产铁载体、降解纤维素能力在各种培养基上的溶解比分别为3.87、2.08、1.26、2.49、4.95(图5)，PT6-1的解蛋白、解淀粉、产铁载体和降解纤维素能力较强，平板透明圈大且明显，利用无机磷能力较弱，平板上仅有较小的透明圈.

图1 菌株PT6-1在不同培养条件下的生长曲线Fig.1 Growth curves of strain PT6-1 under different culture conditions

图3 PT6-1的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of PT6-1

A：平板生长形态；B：革兰氏染色(蓝紫色)，×100(放大倍数)；C：利用无机磷能力测定；D：固氮能力测定；E：利用硅酸盐能力测定；F：产蛋白酶能力测定；G：产淀粉水解酶能力测定；H：产接触酶能力测定；I：产铁载体能力测定；J：产纤维素酶能力测定.图4 PT6-1生理生化特性Fig.4 Physiological and biochemical properties of PT6-1

图5 PT6-1的几种生理生化能力的产生、利用效率Fig.5 Production and utilization efficiency of several physiological and biochemical abilities of PT6-1

2.4 PT6-1菌液对巨菌草、玉米耐盐碱生长的促进效果

施加PT6-1菌液组的巨菌草，相较于对照组株高、茎粗、总鲜质量、地上鲜质量、地下鲜质量、总干质量、地上干质量、地下干质量分别增加了23.1%、25.33%、45.73%、53.29%、27.24%、44.23%、46.19%、32.35%(表1、图6).经PT6-1菌液处理的玉米，相较于对照组株高、茎粗、总鲜质量、地上鲜质量、地下鲜质量、总干质量、地上干质量、地下干质量分别增加了38.03%、35.85%、123.02%、163.63%、56.27%、126.15%、153.66%、72.00%； PT6-1菌液处理组的巨菌草和玉米各项生物量指标相较于其对照组均显著增加，其中玉米相比于巨菌草的增加量更多，总鲜质量、总干质量达到对照组2倍多.施加PT6-1菌液显著增加了巨菌草、玉米在盐碱条件下生物量的积累，PT6-1菌液处理组的巨菌草、玉米叶片相比于对照组颜色更绿，植株更高，根系更加发达.

表1 施加PT6-1菌液的巨菌草、玉米耐盐碱生长的生物量统计1)Table 1 Growth of C. fungigraminus and maize applied with PT6-1 aqueous solution under saline-alkali soils

A：巨菌草地上部分比较；B：对照组巨菌草根系；C：PT6-1处理组巨菌草根系；D：玉米地上部分比较；E：对照组玉米根系；F：PT6-1处理组玉米根系.图6 施加PT6-1菌液对巨菌草、玉米在盐碱条件下生长的影响Fig.6 Effect of PT6-1 aqueous solution on growth of C. fungigraminus and maize under saline-alkali soils

2.5 PT6-1对巨菌草、玉米在盐碱胁迫下光合色素含量、抗氧化酶活性的影响

施加PT6-1菌液组的巨菌草和玉米相比于对照组(图7)，叶片总光合色素含量、叶绿素含量、根系POD活性、叶片CAT活性均显著提高，巨菌草分别提高了156.37%、155.69%、68.14%、11.84%，玉米分别提高了77.26%、81.06%、18.25%、9.59%，但是巨菌草、玉米叶片的SOD活性与对照组无显著差异.在PT6-1处理下，巨菌草和玉米相比于对照组植株，POD、CAT活性显著提高，叶片的叶绿素和光合色素总量显著升高，说明施加PT6-1菌液能提高巨菌草、玉米的POD、CAT活性，帮助其清除自身氧化损伤，增强其耐盐碱生长能力和抗逆性.PT6-1菌液的施加提高了巨菌草、玉米的光合色素和叶绿素的含量，增加了植物的光合作用强度，提高了植物的代谢水平，进而提高植物的干物质积累和植株抗逆性.

A：SOD活性；B：POD活性；C：CAT活性；D：总光合色素含量；E：叶绿素含量.*代表菌液处理组与同植物对照组数据间存在显著差异(P<0.05).图7 施加PT6-1菌液对巨菌草、玉米的光合色素及抗氧化酶活性的影响Fig.7 Effect of PT6-1 aqueous solution on photosynthetic pigments and antioxidant enzyme activities of C. fungigraminus and maize

3 讨论

从福建莆田火龙果根际盐碱土壤中分离、筛选出1株耐盐碱能力最强的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)PT6-1，其最高耐受2.4 mol·L-1的NaCl，最高耐碱pH值为12.PT6-1拥有固氮、溶解无机磷、产铁载体等多种促进植物生长相关的生理生化能力，且能够增加巨菌草、玉米在盐碱胁迫下的生物量积累，可以定义PT6-1是耐盐碱能力较强的根际促生菌.近年来，根际促生菌在促进植物生长、改良生态环境方面被广泛报道.研究表明，贝莱斯芽孢杆菌GB03可以显著提高拟南芥、棉花等植株的抗逆性，促进植物生长，还能参与调控苜蓿结瘤固氮[26].冯健等[27]研究表明，施加解磷细菌能够促进黄瓜吸收土壤中的微量元素，促进黄瓜生长.李艳梅等[28]研究表明，产铁载体芽孢杆菌HSGJ1可以显著提高花生对金属镍胁迫的抗性，提高花生的生物量，铁载体在植物促生、环境修复、临床中具有较大的应用空间[29].

细菌通常通过离子渗透调节和积累小分子化合物帮助自身应对盐碱胁迫[30].微生物、植物和土壤在自然环境中存在着广泛的相互作用[31-32]，细菌对植物耐盐碱能力的影响主要有渗透调节、酶活性调节、激素调节和促生作用等[7].PT6-1主要通过促生作用增强代谢和提高抗氧化酶活性以帮助植物耐盐碱胁迫.施加PT6-1菌液显著提高了巨菌草、玉米在盐碱胁迫下生长的生物量，提高了植株POD活性、CAT活性和总光合色素含量，POD、CAT是植物清除体内氧化损伤的关键酶，反映着植物的抗逆水平和代谢强度[25].盐碱胁迫会降低植物的代谢强度、抑制根系营养吸收、导致叶片气孔关闭.植物的光合作用在盐碱胁迫下会被明显抑制，表现为叶片发黄，光合色素含量、叶绿素含量显著降低等[7].施加PT6-1菌液，显著增加了植株在盐碱胁迫生长条件下的光合色素含量，增强了植物光合作用，PT6-1增强植物耐盐碱的其他机理还有待进一步研究.有研究表明，利用微生物参与改良盐碱地是可行的，并且有较好效果，微生物联合植物治理盐碱地具有成本低、生态和经济效益好等优点，在未来可以逐步替代物理法、化学法而广泛应用于生产实践[33-35].

解淀粉芽孢杆菌被国内外学者研究后报道为一种益生菌[36]，被广泛应用于抑制动植物病原菌.但其耐盐碱促生能力和治理盐碱地的应用却鲜有报道，PT6-1作为分离自盐碱地且耐盐碱能力和促生能力较强的根际益生菌，具有较好的科学研究和应用前景.