珍珠粟WOX家族全基因组鉴定及表达

蒋定坤, 易 超,2, 罗 琳,2, 朱方捷,2,3, 肖嘉靖,3, 林占熺,2

(1.福建农林大学生命科学学院；2.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心;3.福建农林大学海峡联合研究院，福建 福州350002)

在非洲、南亚的干旱和半干旱地区，玉米、高粱等作物均无法种植，珍珠粟(Cenchrusamericanus)则是这些地区重要的作物之一.季节间和季节内的降雨量变化往往是限制珍珠粟产量的重要环境因素之一[1-2].珍珠粟是干旱地区农村贫困人口粮食安全的重要组成部分，但近年来也因其可作为饲料逐渐受到重视.

含有同源结构域蛋白的同源异形盒转录因子被分为14个家族，其中包括与WUSCHEL(WUS)蛋白相关的同源异形盒(WOX)转录因子家族.WOX家族基因编码的转录因子是植物特异性转录因子，具有由60～66个对植物特定功能至关重要的氨基酸组成的“螺旋—环—螺旋—转角—螺旋”保守结构域.根据拟南芥WOX的进化关系将WOX家族基因成员分为3个进化分支，即现代支、中间支、古代支.除了拟南芥，WOX家族基因在核桃[3]、花生[4]、桃树、梨、杏[5]、杨树[6]、水稻、玉米等植物中被广泛研究.在这些植物中，WOX家族基因参与植物生长发育的整体调控，包括茎顶端分生组织发育、侧生器官发育、植物干细胞的形成与维持、花器官生长等.WOX1同源基因已被证实可以控制玉米、矮牵牛、苜蓿、烟草的叶片生长[7-9].近年来，一些研究也表明了WOX家族基因可以在旱稻、棉花、芸苔等作物中响应非生物胁迫和激素刺激.虽然WOX家族基因在多个植物中均有研究，但目前对珍珠粟WOX家族基因成员的鉴定和表达特征研究尚未见报道.

本研究利用生物信息学方法对珍珠粟WOX家族基因进行系统鉴定，并对其编码的蛋白理化性质、保守基序、基因结构进行了分析及启动子区域顺式作用元件预测；通过构建珍珠粟和其他代表性植物WOX家族成员系统发育进化树解析珍珠粟WOX家族基因成员的进化历史；同时使用实时荧光定量PCR检测珍珠粟WOX家族基因成员的表达模式，旨在为进一步探究珍珠粟WOX家族基因功能及其在珍珠粟生长发育中的作用提供有价值的信息.

1 材料与方法

1.1 序列数据下载

珍珠粟、紫象草(Pennisetumpurpureumcv. ‘Purple’)的全基因组数据和基因组注释文件分别来源于NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和国家基因组科学数据中心(CNCB)(https://bigd.big.ac.cn/).拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)的WOX蛋白序列来源于植物转录因子数据库PlantTFDB(http://planttfdb.gao-lab.org/).

1.2 珍珠粟WOX家族基因成员的鉴定

使用HMMER 3.0软件和Pfam数据库(http://pfam-legacy.xfam.org/)中的WOX隐马尔科夫模型文件(PF00046)检索珍珠粟WOX家族基因成员，并以PlantTFDB数据库(http://planttfdb.gao-lab.org/index.php)中的拟南芥WOX蛋白为检索序列在候选珍珠粟WOX家族成员中利用BLAST工具进行比对，设置阈值为1×10-5.利用结构域预测工具SMART(http://smart.embl.de/smart/batch.pl)、NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)验证候选珍珠粟WOX蛋白是否含有WOX结构域，参数为默认参数.

1.3 珍珠粟WOX家族基因结构及蛋白保守序列的预测

使用MEME软件(http://meme-suite.org/tools/meme)分析珍珠粟WOX蛋白的保守序列.最大基序数量设置为10个，最佳基序宽度设置为6～50[10].使用TBtools软件展示WOX家族基因结构和保守基序展示图.提取WOX家族成员结构域序列，使用DNAMAN软件比对并使用SWISS-MODEL网站(https://swissmodel.expasy.org)预测WOX蛋白结构域模型.

1.4 珍珠粟WOX蛋白质理化性质的分析及亚细胞定位的预测

利用在线网站ExPASyProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)对所有候选的WOX蛋白序列进行分子质量、等电点、不稳定系数、亲水系数等理化性质分析.利用CELLO网站(http://cello.life.nctu.edu.tw/)对各蛋白质进行亚细胞定位预测[11].

1.5 珍珠粟WOX家族基因启动子区域顺式作用元件预测

选取珍珠粟WOX家族基因上游2 000 bp的序列为基因启动子序列，利用在线分析网址PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行顺式作用元件预测并利用TBtools软件进行可视化展示.

1.6 珍珠粟WOX家族基因染色体定位

根据基因组注释信息分析珍珠粟WOX家族基因染色体定位及相关结构[12].

1.7 珍珠粟WOX家族基因系统发育进化树的构建

为解析珍珠粟WOX家族基因的进化历史，对珍珠粟、拟南芥、水稻、紫象草等物种WOX家族成员进行系统发育进化分析.根据PlantTFDB数据库中已鉴定的拟南芥、水稻WOX蛋白序列及本地鉴定的珍珠粟、紫象草WOX蛋白序列，利用MUSCLE算法(默认参数)对4个物种WOX蛋白进行多序列比对，并利用IQ-TREE软件(http://www.cibiv.at/software/iqtree)使用最大似然法(MLE)构建系统发育进化树，其中，校验参数Bootstrap值设置为1 000次重复[13-14].使用在线网站EvolView对进化树进行美化.利用MCScanX工具鉴定珍珠粟与水稻、紫象草之间的共线性关系，使用TBtools、Cricos软件进行可视化展示.

1.8 珍珠粟WOX家族基因表达水平的检测

从NCBI数据库下载干旱处理1～144 h共8个时间点的珍珠粟根部转录组数据(登录号:SRX13533560)[15].干旱处理设置为：珍珠粟在播种生长14 d后，用20%聚乙二醇6000(PEG-6000)溶液浇灌.利用Fastp工具对下机数据进行质量控制[16]，将过滤后的测序数据利用Hisat2工具比对到珍珠粟参考基因组中[17]，再利用HTSEQ工具计算各个基因的序列数，并进行标准化，得到不同条件下的基因表达水平(FPKM).利用R包Pheatmap工具对WOX家族基因成员的表达量进行绘图.从上述有表达的WOX家族基因成员中挑选5个进行表达量分析.按照Omega Plant RNA kit试剂盒说明书的步骤提取珍珠粟不同组织(根、茎、叶片、花、种子)样品中的总RNA，用全式金反转录试剂盒ransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成cDNA.采用β-肌动蛋白(β-actin)作为实时荧光定量PCR检测的内参基因，测定基因在不同组织中的相对表达水平[18].WOX基因和内参基因扩增所用的引物序列如附件表Ⅰ(扫OSID码可见)所示.PCR反应体系(20 μL)：8.2 μL超纯水(ddH2O)、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL、1 μL cDNA、10 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix.PCR反应程序:样品预变性95 ℃ 30 s、变性95 ℃ 5 s、退火和延伸60 ℃ 30 s(在此阶段收集荧光信号),总共进行45个循环；60 ℃缓慢递增到95 ℃，每隔0.5 s采集荧光信号构建熔解曲线.采用2-ΔΔCt法对数据进行分析，基因表达水平取来自3个生物学重复样本的平均值.

2 结果与分析

2.1 珍珠粟WOX家族基因成员的鉴定

为了系统鉴定珍珠粟WOX家族基因成员，先通过HMMER软件和BLAST工具比对搜索得到珍珠粟候选WOX家族基因成员，再通过NCBI-CDD和SMART网站对其是否含有WOX结构域进行预测筛选，最终鉴定到15个WOX家族基因成员.

2.2 珍珠粟WOX家族基因结构及蛋白保守序列

通过MEME软件对珍珠粟WOX蛋白进行保守基序预测，结果(图1)显示，WOX家族基因成员具有2个保守基序：基序1、2(附件图Ⅰ，扫OSID码可见).其中仅PMA5G03287缺失基序2，这可能导致该基因与其他WOX家族基因成员在功能上存在差异；而基序1在所有家族基因成员中均存在，为WOX家族基因成员所共有.基序1、2 共同组成了完整的WOX结构域.此外，保守基序3～10仅存在于由PMA5G00052、PMA2G04992、PMA6G00316组成的亚群中，表明该亚群的成员可能存在与其他分支蛋白不同的生物学功能.提取包含WOX蛋白的同源异型结构域序列并用DNAMAN软件进行多序列比对，结果(图2A)显示，位于螺旋1上的Q、L，螺旋2上的P，螺旋3上的W、F、Q、N、R这几个氨基酸高度保守，这几个氨基酸可能是WOX蛋白行使其功能所必需的.PMA2G04992、PMA5G00052、PMA5G03287、PMA6G00316在螺旋2上的氨基酸与其他WOX家族基因成员有差异，这可能影响其功能.使用SWISS-Model网站对WOX蛋白的同源异型结构域进行同源建模，结果(图2B)显示，同源异型结构域由螺旋—环—螺旋—转角—螺旋构成，这一结构在WOX家族基因中高度保守.其中，螺旋—转角—螺旋所组成的HTH结构通过氢键或疏水作用与DNA相结合.

2.3 珍珠粟WOX家族蛋白的理化性质及亚细胞定位

对鉴定的珍珠粟WOX家族蛋白序列进行理化性质分析，结果(附件表Ⅱ，扫OSID码可见)表明，珍珠粟WOX家族蛋白的氨基酸个数为216～859,蛋白质分子质量为24.51～93.10 ku,等电点为5.28～9.35，差异较大.其中，5个为酸性蛋白，等电点小于6.5；7个为碱性蛋白，等电点大于7.5；3个为中性蛋白，等电点为6.5～7.5.蛋白质不稳定系数为49.85～86.36，均大于40，为不稳定蛋白；亲水性指数大多为-0.779～ -0.059，均为负数，表明这些蛋白大多数为亲水蛋白，但亲水程度不同；脂肪系数为50.42～86.63，平均值为58.33，其中，PMA5G00052编码的蛋白脂肪系数最大(86.63)，PMA4G01060编码的蛋白脂肪系数最小(50.42).亚细胞定位预测显示，PMA6G00316、PMA2G04992定位于细胞膜上，PMA5G00052定位于细胞质上，其余定位于细胞核上.

图1 珍珠粟WOX家族基因结构及保守基序Fig.1 Gene structure and conserved motifs of WOX gene family in C.americanus

图2 珍珠粟WOX结构域氨基酸序列比对(A)及三维模型预测(B)Fig.2 Amino acid sequence alignment (A) and three-dimensional model prediction (B) of WOX structural domain in C.americanus

2.4 珍珠粟WOX家族基因启动子区域顺式作用元件

为了研究珍珠粟WOX家族基因可能的调控机制，对其成员在启动子区域(起始密码子上游2 000 bp处)的植物激素响应元件、光响应元件、逆境响应元件、生长发育调节元件等潜在顺式作用元件进行了预测.结果(图3)显示，启动子区域主要存在光响应元件、脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、玉米醇溶蛋白代谢元件、厌氧诱导响应元件、生长素响应元件、防御和应激反应元件、干旱诱导元件、胚乳发育元件、赤霉素响应元件、低温响应元件、分生组织表达元件、水杨酸响应元件、种子特异性响应元件、根特异性元件、类黄酮生物合成基因调控元件等16种已知功能的顺式作用元件.其中，光响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、脱落酸响应元件较多，分别为175、66、57个.PMA5G03287所含顺式作用元件最少，为19个；PMA2G04992所含顺式作用元件最多，为42个.启动子区域均存在光响应元件和脱落酸响应元件，表明光和脱落酸可能调控WOX家族基因的表达；13个启动子区域存在茉莉酸甲酯响应元件.基于功能预测将顺式作用元件划分为不同类别的结果表明，与激素有关的顺式作用元件最多(196个)，其次是光响应元件(175个)、逆境响应元件(53个)、生长发育调节元件(27个).

图3 珍珠粟WOX家族基因启动子区域顺式作用元件预测Fig.3 Prediction of cis-element in promoter of WOX gene family in C.americanus

2.5 珍珠粟WOX家族基因染色体定位

基于全基因组对珍珠粟WOX家族基因进行染色体定位并用TBtools软件进行可视化展示.结果(图4)显示：WOX家族基因成员在6条染色体上均有分布，且分布主要集中在各染色体近末端的位置；有2个基因分布在1号染色体上，1个基因分布在2号染色体上，2个基因分布在3号染色体上，2个基因分布在4号染色体上，3个基因分布在5号染色体上，5个基因分布在6号染色体上，7号染色体上没有基因分布.

图4 珍珠粟WOX家族基因染色体定位Fig.4 Chromosome location of WOX gene family in C.americanus

2.6 珍珠粟WOX家族基因系统发育进化关系及共线性关系

为了进一步分析珍珠粟WOX家族基因成员与其他物种同源基因的进化关系，从PlantTFDB数据库获取了12个水稻家族基因成员(命名为OS-WOX01～12)、18个拟南芥WOX家族基因成员(命名为AT-WOX01～18)，并通过鉴定选取34个紫象草WOX家族基因成员(命名为CP-WOX01～34)，对上述4个物种WOX家族基因成员编码的蛋白序列进行比对并构建系统发育进化树.结果(图5)表明，4个物种79个WOX家族基因成员分为3个类群：古代支、中间支、现代支.古代支包含29个基因(水稻1个、紫象草20个、拟南芥3个、珍珠粟5个)；中间支包含16个基因(水稻5个、拟南芥7个、珍珠粟4个)；现代支包含34个基因(水稻6个、紫象草14个、拟南芥8个、珍珠粟6个)，为3个分支中最多的一个，且珍珠粟中的6个基因均包含WUS基序(T-L-X-L-F-P-X-X).每个分支均有水稻、拟南芥、珍珠粟的WOX家族基因成员分布，这说明珍珠粟物种的分化时间在WOX基因分化之后.

AT表示拟南芥；CP表示紫象草；OS表示水稻.图5 WOX家族基因的系统发育进化树Fig.5 Phylogenetic tree of WOX gene family

基因共线性是指由于基因组或者基因片段复制产生的同源基因，这些基因在序列上有相似性，且相邻基因在染色体上的分布顺序也相似.利用MCScanX软件对珍珠粟WOX家族基因与水稻、紫象草所有基因之间进行物种内和物种间共线性分析，并使用TBtools、Cricos软件将结果进行可视化展示，结果如图6所示.物种内共线性分析(图6A)表明，在珍珠粟WOX家族基因成员中，仅PMA6G04281、PMA1G06013经历了染色体片段复制.物种间共线性分析(图6B)表明，珍珠粟、水稻、紫象草的共线性基因在各染色体上的分布不同，数量不一.珍珠粟5、6号染色体与水稻、紫象草之间的共线性基因较多.水稻与珍珠粟之间有15对基因具有共线性，紫象草与珍珠粟之间有34对基因具有共线性，表明这些基因是由同一个祖先分化而来，且珍珠粟与紫象草的亲缘关系比与水稻的亲缘关系更近.珍珠粟的基因数量是紫象草的一半，说明紫象草的二倍体祖先与珍珠粟具有高度相似的组成结构.

OS01～12表示水稻12条染色体序号；CA01～07表示珍珠粟7条染色体序号；CP01～14表示紫象草14条染色体序号.图6 珍珠粟WOX家族基因物种内(A)和物种间(B)的共线性关系Fig.6 Intra- (A) and inter-species (B) collinearity of WOX gene family in C.americanus

2.7 珍珠粟WOX家族基因成员的表达模式

干旱处理后对珍珠粟根部WOX家族基因成员表达量的转录组数据进行了分析.结果(图7)显示，干旱处理144 h后，PMA6G04281、PMA6G00316、PMA5G03287、PMA5G01807的表达水平均有不同程度的上调，表明这4个基因可能在干旱胁迫的条件下发挥着重要作用.

D表示干旱处理，D_L表示干旱处理时间；CK表示对照处理，CK_L表示对照处理时间.图7 不同时间干旱处理后珍珠粟根部WOX家族基因的表达图谱Fig.7 Expression map of WOX gene family in C.americanus root after different durations of drought treatment

图8 珍珠粟不同组织WOX家族基因的表达图谱Fig.8 Expression map of WOX gene family in different tissues of C.americanus

为了明确WOX家族基因在珍珠粟不同组织中的表达特征，对种子、根、茎、叶、花序5个组织器官WOX家族基因的表达量进行了分析.结果(图8)表明，WOX家族基因成员在珍珠粟不同组织中的表达水平存在明显差异.PMA6G05767、PMA6G05977、PMA2G04992、PMA5G00052、PMA5G03287在根、种子中均为低表达，推测这5个基因与根、种子的生长发育关系不大，其组织表达特性有待进一步验证；PMA6G05767、PMA6G05977、PMA5G00052、PMA5G03287在茎中均为高表达，推测这4个基因与茎的发育有关；PMA2G04992、PMA5G00052、PMA5G03287在花序中均为高表达，而在根、叶、种子、茎中相较于花序均为低表达，推测这3个基因在花序的发育过程中发挥了作用.综上可知，珍珠粟WOX家族基因具有明显的组织表达特异性，暗示着它们在不同组织中的生物学功能可能存在较大差异.

3 讨论

WOX家族基因编码的植物所特有的转录因子在调节植物生长发育及非生物胁迫过程中扮演着重要角色.目前已有研究解析了拟南芥WOX家族基因成员的数量和相关功能.如：WUS基因在拟南芥花药器官的发生过程中能够调控其分化[19]；WOX3基因的突变会导致拟南芥花瓣变窄或缺失[20]；WOX2基因在维持拟南芥胚胎顶细胞正常功能和胚后发育过程中发挥着重要作用[21-22].

目前，WOX家族基因在水稻、高粱、玉米、拟南芥、油菜、棉花等植物中具有相关功能研究[23-25]，但对珍珠粟WOX家族基因的鉴定与分析尚未见报道.本研究鉴定得到了15个WOX家族基因成员，与水稻(13个)[23]、油茶(18个)[26]、中华猕猴桃(16个)[27]中的WOX家族基因成员数量接近，但远少于玉米(31个)[28]、陆地棉(37个)[24]、大豆(33个)[29]的数量.就WOX家族基因而言，珍珠粟具有更大的基因组和更少的基因数量，物种内共线性分析显示仅有一对基因有片段复制，表明珍珠粟在物种演化过程中没有多次基因组倍增事件.蛋白理化性质分析显示，WOX家族基因所编码的蛋白长短不一，分子质量和等电点也存在差异，表明不同WOX家族基因成员可能存在生物学功能差异.其中，绝大多数珍珠粟WOX家族蛋白成员为不稳定的亲水性蛋白且定位于细胞核中，这与蒺藜苜蓿、鹰嘴豆、棉花、苹果、乌拉尔图小麦相似.本研究结果还显示：珍珠粟WOX家族基因成员有2个保守基序(基序1、2)，这两个保守基序共同组成了完整的同源异型结构域；基序1中的W、F、Q、N、R及基序2中的Q、L、P在不同植物(中华猕猴桃、水稻、玉米、拟南芥、甘蓝型油菜)WOX家族基因成员中均高度保守；且这些氨基酸位于结构域的第2、3个α螺旋上，与DNA大沟中碱基的相互作用密切相关.结合珍珠粟和其他植物(玉米、棉花、水稻)染色体定位结果表明，大部分植物WOX家族基因成员在进化过程中在染色体上的位置分布依然保守.

基于最大似然法构建珍珠粟、拟南芥、水稻、紫象草4个物种79个WOX家族蛋白成员系统发育进化树，结合保守基序和基因结构表明，聚类在同一分支下基因成员基序的个数、次序和基因结构均相似，表明珍珠粟WOX家族基因在进化中高度保守.古代支的3个家族基因成员基序个数和外显子个数均远多于现代支和中间支，推测其参与调控的过程，功能与其他成员有所不同.值得注意的是,紫象草WOX家族基因与大多数植物均含有3个分支不同，仅在现代支和古代支有分布，缺少中间支成员，这与毛竹[30]类似，可能存在独特的进化方式.

本研究结果表明：在WOX家族基因启动子区域存在着大量与植物生长发育、激素响应、环境胁迫相关的顺式作用元件；在15个启动子区域中均发现脱落酸响应元件，脱落酸具有降低和抵御干旱的作用[31]，推测珍珠粟WOX家族基因主要受脱落酸调控，从而抵御干旱；大部分珍珠粟WOX家族基因成员含有多个相同的顺式作用元件.在启动子区域存在着数量和种类不同的顺式作用元件可能反映了基因在转录水平上的功能差异.

已有研究表明，拟南芥WOX13、WOX14在花中均有表达[32]，参与花器官的形成和花药发育.WOX同源基因在矮牵牛[33]、番茄[34]的花瓣发育过程中也发挥着重要作用.本研究结果表明，在珍珠粟花序、茎中分别存在3和4个高表达WOX家族基因成员，推测其在花器官和茎尖分生组织中发挥了调控作用.