基于Nrf2/HO-1通路的柴胡皂苷A对A549细胞顺铂敏感性的影响

高薇，王佳勇

海军军医大学长海医院，上海200433

肺癌是全球癌症死亡的主要原因，5年生存率低于15%，其中80%～85%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[1]。尽管NSCLC早期检测和系统治疗取得一些进展，但患者预后仍较差[2]。NSCLC化疗药物存在耐药性、疗效不理想、价格昂贵等局限性。因此，亟需新的安全有效治疗策略[3]。越来越多证据表明，中药可降低化疗和放疗毒性，减轻癌症症状，提高患者生存率[4]。顺铂是常用的化疗药物，但由于耐药性问题，常使细胞对顺铂的敏感性降低，从而降低化疗效果。

柴胡皂苷A是从柴胡中提取的一种三萜皂苷[5]，具有抗炎[6]、抗氧化[7]、抗肿瘤[8]等多种药理活性。柴胡皂苷A可通过上调细胞自噬水平抑制Huh-7细胞增殖，发挥抗肝癌作用[9]；通过抑制ERK蛋白磷酸化促进鼻咽癌细胞凋亡，发挥抗鼻咽癌作用[10]；通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路提高人肺腺癌顺铂耐药性细胞（A549/DDP）对顺铂的敏感性，逆转A549/DDP细胞顺铂耐药性[11]。基于此，本研究探究柴胡皂苷A与顺铂联用对人肺腺癌A549细胞的影响及可能的作用机制，为NSCLC的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与细胞

柴胡皂苷A（批号149158，纯度≥98%）、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1，批号119396，纯度≥98%）上海陶术生物科技有限公司。A549细胞株，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM 培养基（货号8118031），美国Gibco 公司；胎牛血清（FBS，货号SV30087.02），美国HyClone 公司；ECL 发光液（货号WP20005）、BCA蛋白定量试剂盒（货号23225）、C11-BODIPY荧光探针（货号D3861），美国Thermo公司；FeRhonox-1亚铁离子荧光探针（货号GC901），日本Goryo Chemical公司；PVDF 膜（货号IPVH00010），美国Millipore；CCK8（货号C0038）、DCFH-DA 荧光探针（货号MB4682），大连美仑生物；溶质载体家族7 成员11（SLC7A11）抗体（货号ab175186）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抗体（货号ab125066）、转铁蛋白（Transferrin）抗体（货号ab214039）、溶质载体家族40成员1（SLC40A1）抗体（货号ab239538）、核因子E2相关因子2（Nrf2）抗体（货号ab62352）、血红素加氧酶（HO-1）抗体（货号ab52947）、β-actin 抗体（货号ab8226）、HRP标记二抗（货号ab150077），英国Abcam公司。SpectraMax iD3多模式酶标仪（澳大利亚SpectraMax），FACS Calibur 流式细胞仪（美国Becton Dickinson），1300 SERIES A2 CO2细胞培养箱（美国Thermo Scientific），Mini-PROTEAN Tetra System电泳系统、ChemiDoc MP Imaging System凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad）。

1.3 细胞培养

A549 细胞用DMEM 完全培养基（含10% FBS、1%双抗），置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，1～2 d传代一次，取对数生长期细胞进行实验。

1.4 柴胡皂苷A和顺铂浓度筛选

将A549细胞以6×103个/孔接种于96孔板，放入培养箱中培养过夜，将细胞分为对照组和药物组，每组3个复孔，对照组加入空白培养基，药物组分别以终浓度为3.25、7.5、15、30、60、120、240、480 μmol/L柴胡皂苷A 或0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L顺铂处理细胞24 h，同时设置只加培养基的空白孔调零。每孔加入10 μL CCK8溶液，培养箱继续培养2 h，酶标仪波长450 nm处测定各孔吸光度（A），计算细胞存活率[（A药物-A空白）/（A对照-A空白）×100%]，并用GraphPad软件计算药物IC50。

将细胞分为对照组、顺铂组、柴胡皂苷A组及联用组，按以上方法培养，根据筛选出的IC50分别处理细胞，测定各孔吸光度，计算细胞存活率及抑制率（100%-存活率）。采用协同指数q评价2种药物联用的效果[12]。q=EAB/（EA+EB-EA×EB），式中EAB表示A、B两药联合使用的抑制率，EA、EB表示A、B单用的抑制率，q≤0.85表示两药拮抗，0.85

1.5 细胞克隆形成分析

将A549细胞消化成单细胞悬液，以1 000个/孔接种于12孔板，置于培养箱中培养2 d。将细胞分为对照组、顺铂组（5 μmol/L）、柴胡皂苷A组（40 μmol/L）及联用组（40 μmol/L柴胡皂苷A+5 μmol/L顺铂），分别加入相应药物，对照组加入空白培养基，置于培养箱中继续培养11 d。PBS洗2次，4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS 洗1 次，1%结晶紫溶液染色10 min，PBS洗3次，室温晾干，显微镜下观察3个视野中的细胞克隆数量。

1.6 脂质过氧化检测

将A549细胞以1×105个/孔接种于12孔板，待细胞过夜贴壁后，将细胞分为对照组、顺铂组（5 μmol/L）、柴胡皂苷A组（40 μmol/L）及联用组（40 μmol/L柴胡皂苷A+5 μmol/L顺铂），分别加入相应培养基处理24 h。加入2 μmol/L C11-BODIPY荧光探针，37 ℃避光孵育30 min，共聚焦显微镜观察并拍照，Image J 1.6软件计算相对荧光强度（实验组荧光强度/对照组荧光强度）。

1.7 Fe2+含量检测

将A549细胞以1×105个/孔接种于12孔板，待细胞过夜贴壁后，将细胞分为对照组、顺铂组（5 μmol/L）、柴胡皂苷A组（40 μmol/L）及联用组（40 μmol/L柴胡皂苷A+5 μmol/L顺铂），分别加入相应培养基处理24 h。加入5 μmol/L FeRhonox-1荧光探针，避光孵育1 h，共聚焦显微镜观察并拍照，Image J1.6软件计算相对荧光强度。

1.8 谷胱甘肽和乳酸脱氢酶含量检测

将A549细胞以2.5×105个/孔接种于6孔板，待细胞贴壁后，将细胞分为对照组、顺铂组（5 μmol/L）、柴胡皂苷A组（40 μmol/L）及联用组（40 μmol/L柴胡皂苷A+5 μmol/L顺铂），分别加入相应培养基处理24 h。收集细胞上清液，按试剂盒说明书检测乳酸脱氢酶（LDH）含量。加入RIPA裂解液裂解细胞，收集细胞裂解液，按试剂盒说明书检测细胞内谷胱甘肽（GSH）含量。

1.9 RT-PCR检测

将A549细胞以2.5×105个/孔接种于6孔板，待细胞贴壁后，将细胞分为对照组、顺铂组（5 μmol/L）、柴胡皂苷A组（40 μmol/L）及联用组（40 μmol/L柴胡皂苷A+5 μmol/L顺铂），分别加入相应培养基处理24 h。收集细胞，根据试剂盒说明书提取总RNA，使用Prime ScriptTMRT Master 和TB Green®Premix Ex TaqTM进行反转录和RT-PCR。以GAPDH 为内参，2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物由上海生工合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.10 Western blot检测

将A549细胞以2.5×105个/孔接种于6孔板，待细胞贴壁后，将细胞分为对照组、顺铂组（5 μmol/L）、柴胡皂苷A组（40 μmol/L）及联用组（40 μmol/L柴胡皂苷A+5 μmol/L顺铂），分别加入相应培养基处理24 h。加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解15～30 min，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，分离上清液，BCA法测定蛋白浓度，加入5×loading buffer，100 ℃金属浴10 min使蛋白变性，20 μg蛋白样品经凝胶电泳（80 V、30 min，120 V、1.5 h）后转至PVDF膜（冰浴，200 mA，2 h），加入5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗涤3次，每次8 min，滴加SLC7A11、GPX4、Transferrin、SLC40A1、Nrf2、HO-1 一抗（均为1∶1 000）及GAPDH 一抗（1∶2 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次8 min，加入HRP标记二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次8 min。采用ECL显影液显色，凝胶成像系统拍照，Image J 1.6软件分析蛋白灰度值。

1.11 统计学方法

采用GraphPad Prism 6.0 统计软件进行分析。实验数据以表示，组间比较用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 柴胡皂苷A与顺铂联用对A549细胞存活率的影响

随着柴胡皂苷A和顺铂浓度增加，A549细胞存活率呈逐渐降低趋势，其IC50分别为43.5、5.4 μmol/L，见图1。故选择柴胡皂苷A 40 μmol/L、顺铂5 μmol/L进行后续实验。

图1 不同浓度柴胡皂苷A和顺铂处理的A549细胞存活率（xˉ±s，n=3）

与对照组比较，顺铂组、柴胡皂苷A组及联用组A549细胞存活率显著降低（P<0.05，P<0.01）；与顺铂组比较，联用组A549 细胞存活率显著降低（P<0.01）。结果见表2。q值计算结果显示，柴胡皂苷A（40 μmol/L）与顺铂（5 μmol/L）联用具有协同作用（q=1.21）。

表2 各组A549细胞存活率比较（，%）

表2 各组A549细胞存活率比较（，%）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与顺铂组比较，##P<0.01

2.2 柴胡皂苷A与顺铂联用对A549细胞克隆数目的影响

与对照组比较，顺铂组、柴胡皂苷A组和联用组A549细胞克隆数目显著减少（P<0.05，P<0.01）；与顺铂组比较，联用组A549 细胞克隆数目显著减少（P<0.01）。见表3、图2。

表3 各组A549细胞克隆数目比较（，个）

表3 各组A549细胞克隆数目比较（，个）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与顺铂组比较，##P<0.01

图2 各组A549细胞克隆形成

2.3 柴胡皂苷A与顺铂联用对A549细胞脂质过氧化水平的影响

与对照组比较，柴胡皂苷A组和联用组A549细胞脂质过氧化水平显著升高（P<0.01）；与顺铂组比较，联用组A549细胞脂质过氧化水平显著升高（P<0.01）。见表4、图3。

表4 各组A549细胞脂质过氧化水平比较（）

表4 各组A549细胞脂质过氧化水平比较（）

注：与对照组比较，**P<0.01；与顺铂组比较，##P<0.01

图3 各组A549细胞脂质过氧化阳性表达（C11-BODIPY探针，×63）

2.4 柴胡皂苷A与顺铂联用对A549细胞Fe2+含量的影响

与对照组比较，柴胡皂苷A组和联用组A549细胞Fe2+含量显著升高（P<0.01）；与顺铂组比较，联用组A549细胞Fe2+含量显著升高（P<0.05）。见表5、图4。

表5 各组A549细胞Fe2+含量比较（）

表5 各组A549细胞Fe2+含量比较（）

注：与对照组比较，**P<0.01；与顺铂组比较，#P<0.05

图4 各组A549细胞Fe2+阳性表达（FeRhonox-1探针，×63）

2.5 柴胡皂苷A与顺铂联用对A549细胞谷胱甘肽和乳酸脱氢酶含量的影响

与对照组比较，柴胡皂苷A组和联用组A549细胞GSH含量显著减少（P<0.05），细胞上清液LDH含量显著增加（P<0.05）；与顺铂组比较，联用组A549细胞GSH含量显著减少（P<0.01），细胞上清液LDH含量显著增加（P<0.01）。结果见表6。

表6 各组A549细胞GSH和上清液LDH含量比较（）

表6 各组A549细胞GSH和上清液LDH含量比较（）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与顺铂组比较，##P<0.01

2.6 柴胡皂苷A与顺铂联用对A549细胞铁死亡相关指标表达的影响

PCR 结果显示，与对照组比较，柴胡皂苷A 组A549 细胞SLC7A11 和GPX4 mRNA 表达显著降低（P<0.05），SLC40A1表达显著升高（P<0.01），联用组A549细胞SLC7A11和GPX4 mRNA表达显著降低（P<0.05）、SLC40A1 和Transferrin mRNA 表达显著升高（P<0.05，P<0.01）；与顺铂组比较，联用组A549细胞SLC7A11、GPX4、SLC40A1 mRNA 表达显著降低（P<0.05，P<0.01），Transferrin mRNA 表达显著升高（P<0.01）。结果见表7。

表7 各组A549细胞SLC7A11、GPX4、Transferrin、SLC40A1 mRNA表达比较（）

表7 各组A549细胞SLC7A11、GPX4、Transferrin、SLC40A1 mRNA表达比较（）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与顺铂组比较，#P<0.05，##P<0.01

Western blot结果显示，与对照组比较，柴胡皂苷A组和联用组A549细胞SLC7A11和GPX4蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01），Transferrin和SLC40A1蛋白表达显著升高（P<0.05，P<0.01），顺铂组A549细胞SLC40A1蛋白表达显著升高（P<0.01）；与顺铂组比较，柴胡皂苷A组和联用组A549细胞SLC7A11和GPX4 蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01），Transferrin蛋白表达显著升高（P<0.01），SLC40A1蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。见图5。

图5 各组A549细胞SLC7A11、GPX4、Transferrin、SLC40A1蛋白表达比较（，n=3）

2.7 抑制铁死亡对A549细胞顺铂敏感性的影响

为考察铁死亡对A549细胞顺铂敏感性的影响，在原有分组基础上使用铁死亡抑制剂Fer-1（10 μmol/L）处理细胞2 h，再加入相应药物培养24 h，分别检测细胞存活率、脂质过氧化水平、Fe2+含量及SLC7A11和GPX4蛋白表达。结果显示，Fer-1处理后细胞存活率显著升高（P<0.05），细胞内脂质过氧化水平和Fe2+含量降低（P<0.05），铁死亡相关蛋白SLC7A11和GPX4表达升高。见图6。

图6 各组A549细胞存活率、脂质过氧化水平、Fe2+含量及铁死亡相关蛋白表达比较（，n=3）

2.8 柴胡皂苷A 与顺铂联用对A549 细胞Nrf2/HO-1通路的影响

与对照组比较，柴胡皂苷A组和联用组A549细胞Nrf2 和HO-1 mRNA 及蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）；与顺铂组比较，联用组A549 细胞Nrf2 和HO-1 mRNA及蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表8、图7。这些结果表明，柴胡皂苷A与顺铂联用能够抑制Nrf2/HO-1通路，破坏细胞抗氧化系统，加强细胞铁死亡。

表8 各组A549细胞Nrf2、HO-1 mRNA表达比较（）

表8 各组A549细胞Nrf2、HO-1 mRNA表达比较（）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与顺铂组比较，#P<0.05，##P<0.01

图7 各组A549细胞Nrf2、HO-1蛋白表达比较（，n=3）

3 讨论

本研究使用柴胡皂苷A和与低浓度顺铂同时处理A549细胞，发现柴胡皂苷A能够增强A549细胞对顺铂的敏感性，抑制细胞增殖，联合用药具有协同作用。提示二者联合应用能增强顺铂NSCLC抗肿瘤作用，是一种有潜力的治疗策略。

铁死亡是细胞程序性死亡的方式，其特征是铁代谢产生的脂质过氧化产物和活性氧（ROS）积累，细胞破裂引起LDH释放增多[13]。研究表明，铁死亡是肿瘤生长的重要调控因子，主要由SLC7A11和GPX4被抑制引起。GPX4是一种依赖GSH的硒酶，抑制GPX4导致GSH介导的抗氧化活性下降及脂质过氧化水平升高，从而引起铁死亡[14]。SLC7A11是一种胱氨酸-谷氨酸逆向转运体，能将细胞外胱氨酸转运到细胞中，然后将其加工成半胱氨酸，半胱氨酸能参与体内多种氧化还原反应，对细胞具有一定保护作用。SLC7A11失活导致细胞内半胱氨酸含量降低，进一步导致GSH含量降低，促进细胞铁死亡。Transferrin主要作用是将Fe2+导入细胞内，而SLC40A1负责将Fe2+从细胞内运输到细胞外，二者对维持细胞内Fe2+平衡至关重要。Transferrin表达升高及SLC40A1表达降低导致细胞内Fe2+积累，从而促进细胞铁死亡[15]。诱导铁死亡可以抑制肿瘤生长，为抗肿瘤治疗提供新思路。本研究结果显示，与顺铂组比较，柴胡皂苷A与顺铂联用能促进A549细胞LDH释放，进一步表明柴胡皂苷A能增强A549细胞对顺铂的敏感性，此外，还能降低铁死亡相关SLC7A11、GPX4蛋白和mRNA表达，提高细胞内脂质过氧化水平，减少细胞内GSH 含量，下调SLC40A1蛋白表达，上调Transferrin蛋白表达，维持细胞内Fe2+含量，促进细胞铁死亡。

Nrf2/HO-1抗氧化通路在铁死亡中起重要作用，为避免处于持续的氧化应激微环境中，肿瘤细胞可通过中和氧化应激减轻细胞中过氧化脂质生成，从而抵抗铁死亡。Nrf2是抗氧化和解毒的主要调控因子，被认为是一种细胞保护因子，通过与下游抗氧化反应元件结合减轻脂质过氧化水平，抑制铁死亡。HO-1受Nrf2转录调控，转录因子Nrf2启动内源性抗氧化反应元件，并激活若干下游抗氧化酶（如HO-1）表达，且铁死亡关键因子SLC7A11、GPX4、SLC40A1都受Nrf2转录调控[16-17]。本研究发现，顺铂能促进A549细胞HO-1表达，激活Nrf2/HO-1抗氧化通路，而柴胡皂苷A单用及与顺铂联用均能降低Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表达，提示柴胡皂苷A 能抑制Nrf2 核易位，抑制Nrf2/HO-1通路。这些结果表明，柴胡皂苷A抑制了顺铂诱导的Nrf2/HO-1通路激活，进而促进过氧化脂质生成，进一步促进铁死亡。

综上所述，柴胡皂苷A与顺铂联用能诱导A549细胞铁死亡，其机制可能与破坏细胞氧化还原稳态，提高细胞内脂质过氧化水平及Fe2+含量，降低GSH含量及 SLC7A11、GPX4、SLC40A1 表达，上调Transferrin表达，抑制Nrf2/HO-1通路有关。本研究可为NSCLC的辅助治疗提供实验依据。