GEO基因芯片结合网络药理学和分子对接技术探讨人参-茯苓-白术配伍治疗鼻咽癌作用机制及验证

王斐，朱镇华

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007

鼻咽癌是一种头颈部恶性肿瘤，具有病情隐匿的特点，70%的患者确诊时已为晚期[1-2]。目前针对鼻咽癌的治疗方案主要为放疗与化疗联合应用[3]，但多存在远处转移及复发问题[4-6]。放化疗常见唾液腺损伤、放射性皮肤损伤、耳鼻损伤等不良反应[7]。寻找优于现阶段治疗的方案，提高鼻咽癌治疗的安全性及有效性是临床亟待解决的问题。

中医耳鼻咽喉科临床常见慢性疾病皆可追溯到脾虚的病机基础。其病机大体为肺脾气虚，无力托邪，外邪入里而为病。参苓白术散是中医耳鼻咽喉科常用方剂，为健脾祛湿的代表方之一，药理学研究表明其具有良好的免疫调节效应及抗炎作用[8-10]。近年来，课题组在临床中发现参苓白术散对鼻咽癌防治具有较好效果，但其具体分子机制尚不明确。目前，参苓白术散防治鼻咽癌的相关研究较少。本研究利用GEO基因芯片结合网络药理学及分子对接技术对参苓白术散君药人参-茯苓-白术配伍防治鼻咽癌的分子机制进行探讨，并通过CCK-8法及Western blot实验进行验证，以此推测参苓白术散在鼻咽癌防治过程中的作用，为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 鼻咽癌靶点获取

以“Nasopharyngeal carcinoma”为关键词，检索GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），获得正常人群与鼻咽癌患者的高通量测序数据集。通过R语言软件进行分析筛选，以|logFC|>1且Padj<0.05为条件筛选差异表达基因，绘制火山图和热图。

1.2 人参-茯苓-白术配伍化学成分筛选

利用TCMSP 数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）分别检索人参、茯苓、白术的化学成分，以毒药物动力学（ADME）[11]标准口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为条件，对3种中药的化学成分进行筛选，得到人参-茯苓-白术配伍有效成分。

1.3 有效成分靶点获取

使用TCMSP检索人参-茯苓-白术有效成分相关靶点基因，并通过UniProt 数据库（http://www.uniprot.org/）对靶点名称进行标准化处理。

1.4 化合物-交集靶点网络及蛋白相互作用网络构建

利用Perl语言软件获得人参-茯苓-白术有效成分靶点基因与鼻咽癌差异表达基因的交集靶点，导入Cytoscape3.8.2软件构建化合物-交集靶点网络。并将其导入STRING11.0（https://string-db.org），得到蛋白相互作用网络，以大于中位值为标准筛选核心作用靶点。

1.5 GO及KEGG通路富集分析

运用R 语言软件ggplot2、clusterProfiler、enrichplot、org.Hs.eg.db 包对交集靶点进行GO 和KEGG通路富集分析，得到人参-茯苓-白术配伍作用于鼻咽癌的主要通路，并对结果进行可视化处理。

1.6 交集靶点-KEGG关系网络构建

将人参-茯苓-白术配伍作用于鼻咽癌的主要通路与对应交集靶点文件导入Cytoscape3.8.2软件构建交集靶点-KEGG关系网络并进行分析。

1.7 分子对接验证

通过UniProt 数据库搜索鼻咽癌靶点蛋白，在RCSB PDB数据库下载蛋白质晶体结构，在PubChem资源库下载中药有效成分2D结构，利用Chem3D软件进行能量最小化处理，使用Sybyl软件进行分子对接。

1.8 体外实验验证

1.8.1 细胞株

人鼻咽癌细胞5-8F（低分化，北纳创联生物技术研究院），经本实验室传代培养。

1.8.2 试剂与仪器

PLAU，武汉三鹰公司，批号17968-1-AP；环加氧酶2（COX2），美国CST公司，批号12282T；c-JUN，CST公司，批号9165T；β-谷甾醇、苏齐内酯、豆甾醇、花生四烯酸，上海源叶生物科技有限公司，批号分别为B21972-20mg、B51017-5mg、B20314-20mg、B20540-20mg。NU-5810E型CO2培养箱，美国Forma公司；JY-600HE电泳仪、JY-ZY5电泳槽、JY-SCZ2+转印槽，北京君意东方电泳设备有限公司；Microfuge 20R 高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；MS105 DU电子天平，瑞士Mettler-Toledo公司；BWS-27恒温水浴箱，美国Pharmacia公司；AE2000倒置显微镜，日本Olympus公司；ELX800酶标仪，美国Bio-Tek公司；DW-HL388超低温冰箱，美国Fisher公司；SJ-CJ-2FD单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；select涡旋振荡器，美国SBP公司。

1.8.3 CCK-8法检测细胞增殖

取对数生长期的5-8F人鼻咽癌细胞，种入96孔板（每100 μL培养液中5×103个细胞），待细胞贴壁，每孔分别加入不同浓度的200 μL含药培养液，实验组分别使用5、10、20、40、80 μmol/L花生四烯酸、苏齐内酯、豆甾醇及β-谷甾醇。设定空白孔（只加细胞培养液、不加5-8F细胞）用于吸光度（A值）校正。待药物作用24、36、48 h后，将现配的CCK-8溶液100 μL分别加入包括空白孔的所有孔内，继续培养2 h。实验重复3次。于酶标仪波长450 nm处检测A值，计算细胞相对增殖率[（实验组A值-空白组A值）÷（对照组A值-空白组A值）×100%]。

1.8.4 Western blot检测蛋白表达

取对数生长期5-8F人鼻咽癌细胞，接种至培养皿，待细胞贴壁，设置溶剂对照组，并加入不同浓度含药培养基（20、40 μmol/L花生四烯酸、苏齐内酯、豆甾醇及β-谷甾醇）药物干预36 h后，提取总蛋白，参考胡晶等[12]方法进行蛋白定量、电泳、转膜、扫膜，并分析信号值，分别监测分子对接所对应的靶点蛋白（PTGS2、PLAU、JUN）。实验重复3次。

1.8.5 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料数据均服从正态分布，以表示，多组间比较和单因素设计采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌差异表达基因

通过检索GEO数据库，确定GPL6480数据集，该芯片数据集收集了18个正常人群鼻咽组织和18个原发鼻咽癌原发组织的基因表达谱。使用R语言软件下载并分析原始数据，以Padj<0.05且|logFC|>1为条件进行差异分析后获得2 078个鼻咽癌差异表达基因，其中包含1 214个下调基因和864个上调基因，利用R语言绘制火山图，见图1。选取20个上调基因及20个下调基因绘制热图，见图2。

图1 鼻咽癌GPL6480数据集差异表达基因火山图

图2 鼻咽癌GPL6480数据集差异表达基因FC分析热图

2.2 人参-茯苓-白术有效成分

利用TCMSP平台检索人参、茯苓、白术的主要化学成分，以OB≥30%和DL≥0.18为条件筛选出有效化学成分共44种，其中人参22种、白术7种、茯苓15种，见表1。

表1 人参-茯苓-白术有效成分信息

2.3 化合物-交集靶点网络

应用Perl语言分析获得鼻咽癌差异表达基因与人参-茯苓-白术对应靶点基因的交集靶点共21个，与交集靶点相互作用的有效化合物共23个。以交集靶点与有效化合物数据构建化合物-交集靶点网络，见图3。该网络共有44个节点和50条边。人参、茯苓、白术中多个有效化合物可对应相同的靶点，而不同靶点也可对应同一有效化合物，表明人参-茯苓-白术配伍多成分、多靶点作用于鼻咽癌的特点。

图3 人参-茯苓-白术治疗鼻咽癌化合物-交集靶点网络

2.4 交集靶点蛋白相互作用分析

将21个交集靶点导入STRING平台，设置置信度>0.150，剔除没有相互关系的靶点，得到图4A。设置置信度>0.400，提取图4A 中关联更紧密的网络，得到图4B。将数据导入Cytoscape3.8.2，利用cytoNCA插件及R语言，以大于中位值为条件筛选核心基因，得到图4C，提取核心基因，生成网络，见图4D。分析得到JUN、IL1B、PLAU、STAT1、PTGS2 共5 个核心靶点，可认为这些靶点在网络中起重要作用。

图4 人参-茯苓-白术治疗鼻咽癌交集靶点蛋白相互作用网络分析

2.5 GO及KEGG通路富集分析

对交集靶点进行GO和KEGG通路富集分析。以Padj<0.05为标准分别确定前15个生物过程（BP）、分子功能（CC）、细胞成分（MF）的GO条目，见图5。可以看出，相关性最大的生物过程有活性氧生物合成过程、一氧化氮生物合成过程、一氧化氮代谢过程、活性氮类代谢过程等，分子功能有类固醇结合、丝氨酸型内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸水解酶活性等，细胞成分有细胞器外膜等。交集靶点KEGG通路富集分析见图6，主要涉及肿瘤、代谢、免疫、炎症等方面信号转导。

图5 人参-茯苓-白术治疗鼻咽癌交集靶点GO功能富集分析

图6 人参-茯苓-白术治疗鼻咽癌交集靶点KEGG通路富集分析

2.6 交集靶点-KEGG关系网络

将人参-茯苓-白术配伍治疗鼻咽癌涉及的主要通路与对应交集靶点导入Cytoscape3.8.2软件构建交集靶点-KEGG关系网络（见图7）。该网络有41个节点（21个交集靶点节点和20个通路节点）和77条边。可以看出，IL1B、JUN 基因及Leishmaniasis 信号通路（hsa05140）、Rheumatoid arthritis 信号通路（hsa05323）、IL-17信号通路（hsa04657）、Fluid shear stress and atherosclerosis信号通路（hsa05418）在该网络中起到核心调控作用。

图7 人参-茯苓-白术治疗鼻咽癌交集靶点-KEGG关系网络

2.7 分子对接

将鼻咽癌靶点蛋白导入Sybyl软件，加氢并修复侧链后基于Ligand（配体）模式（未发现配体的使用automatic 模式）产生活性口袋，以SFXC 格式保存，其他参数均设为默认值。将已进行能量优化的人参-茯苓-白术有效化合物导入软件，依次与相应的靶点蛋白进行对接，对接结果根据Total-Score 进行评价，以Total-Score>5为阈值，该值越大，表明配合作用越好。对接结果见表2，对接模式见图8。

表2 人参-茯苓-白术有效成分与靶点蛋白分子对接结果

图8 人参-茯苓-白术有效成分与靶点蛋白分子对接模式

2.8 体外实验结果

2.8.1 CCK-8法检测细胞增殖

药物干预24、36、48 h，与对照组比较，不同浓度花生四烯酸、苏齐内酯、豆甾醇、β-谷甾醇均可抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖（P<0.05，P<0.01），见图9。

图9 人参-茯苓-白术有效成分对5-8F细胞增殖的抑制作用

2.8.2 Western blot检测蛋白表达

根据分子对接结果，花生四烯酸与PTGS2、苏齐内酯与PTGS2、豆甾醇与PLAU、β-谷甾醇与JUN配合效果好。Western blot结果显示，与对照组比较，花生四烯酸组和苏齐内酯组PTGS2表达降低（P<0.05，P<0.01），豆甾醇组PLAU表达降低（P<0.01），β-谷甾醇组c-JUN表达降低（P<0.01）。见图10。

图10 人参-茯苓-白术治疗鼻咽癌有效化合物对靶点蛋白表达的影响

3 讨论

鼻咽癌属中医学“上石疽”“失荣”“真头痛”等范畴，现代亦称为“颃颡岩”，多为正气亏虚，气虚染毒所致。脾为气血生化之源，脾气健则气血生化有源，正气足则外毒无以入侵。参苓白术散以人参、茯苓、白术为君药，方中人参大补脾胃之气，并鼓动全身正气，白术、茯苓健脾渗湿，脾气健而气血生化有源。

本研究利用GEO数据库得到2 078个鼻咽癌差异表达基因。利用TCMSP数据库获得人参-茯苓-白术44种有效化学成分，二者交集靶点21个，包括PTGS2等5 个核心靶点。对核心靶点进行蛋白相互作用分析、GO和KEGG通路富集分析，发现主要通过活性氧及一氧化氮生物合成过程、类固醇结合等生物过程，及代谢、炎症等通路发挥作用。

研究发现，花生四烯酸可通过抑制代谢产物的生成途径抑制促炎症因子的表达，起到保护血管内皮和抗炎的作用[13]；另外，花生四烯酸及其代谢产物在肿瘤细胞增殖和转移、凋亡、血管新生和炎症反应及其治疗和预后方面具有重要作用[14]。体外实验表明，豆甾醇能抑制肝癌、胃癌、皮肤癌等多种肿瘤细胞生长，其机制主要涉及上调凋亡基因表达，诱导细胞周期阻滞、破坏肿瘤血管的生成等[15]。β-谷甾醇能通过多种细胞信号途径抑制多种癌症如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌等的发生与发展[16]。

PTGS2是合成前列腺素的关键酶，即COX-2，可将花生四烯酸转化为PGH2进而导致炎症[17]。COX-2高表达可见于许多肿瘤，能诱导致癌物的活化，促进肿瘤血管生成、肿瘤浸润和转移，影响细胞周期变化，促进细胞增殖，抑制凋亡，并可能降低肿瘤细胞对放疗及化疗的敏感性[18-23]。朱德为等[24]对79例鼻咽癌患者的鼻咽组织进行免疫组化检测，发现COX-2总阳性率达63.3%。朱洪海等[25]研究104例鼻咽癌患者，发现COX-2在有淋巴结转移的患者比例更高，提示COX-2可能与鼻咽癌的复发及远处转移相关。

综上所述，人参-茯苓-白术治疗鼻咽癌可从多成分、多靶点、多通路对疾病发展进行调控。本研究以参苓白术散的临床功效为基础，选取其君药进行分析。基于上述结果，后续可从以下几方面进行探索：围绕参苓白术散复方开展“病-证-方”关联网络研究，在临床实践基础上构建“鼻咽癌-脾虚湿盛证-参苓白术散”模型，开展更广泛的临床及基础研究，为鼻咽癌的临床治疗提供新思路；对参苓白术散的核心成分如花生四烯酸、豆甾醇和β-谷甾醇等展开更多基础研究，如拆方验证、血清药理学和动物细胞模型验证等；进一步探索PTGS2与鼻咽癌的相关性。本研究尚存在一定局限性：研究局限于参苓白术散君药，未纳入其他药物；中药复方成分复杂，活性成分之间的相互作用、各靶点的调控强度等因素未能纳入计算。