以粗粮为基质保藏米根霉的保存时间研究

陈思达 陈沙 张凤英

摘要：对以粗粮为基质保藏米根霉种的保存时限进行了探讨。将不同年份的3株根霉种及其转接制备的新鲜麸皮菌种，用于发酵糯米，测定发酵液的糖度，来衡量保存多年的根霉种的糖化酶活力和遗传稳定性。结果表明，保存3～8年的根霉种的酶活力变化很小；不同年份的3株根霉种及其转接制备的新鲜菌种的酶活力与当年不相上下。由此可知，在4～7 ℃米根霉以粗粮为保藏基质的保存时限可达8年以上，且遗传稳定性良好。

关键词：米根霉；粗粮；糖度；酶活力；保存时限

中图分类号：TS261.1 文献标志码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20230525

Study on the preservation time of coarse grains cultures of Rhizopus oryzae

Chen Sida1， Chen Sha1， Zhang Fengying2

（ 1. Food Inspection and Testing Research Institute of Jiangxi General Institute of Testing and Certification， Nanchang， Jiangxi 330052； 2. School of Food Science and Technology， Jiangxi Agricultural University， Nanchang， Jiangxi 330045 ）

Abstract： In this paper， the preservation time of coarse grains cultures of Rhizopus oryzae was discussed. The three R. oryzae strains cultures from different years and the fresh wheat bran cultures transferred by the former were used to ferment glutinous rice. Saccharification enzyme activity and genetic stability of the preserved R. oryzae strains were measured by detecting the sugar content of the fermentation liquid. The results showed that the enzyme activity of R. oryzae strains stored for 3～8 years had little change. The enzyme activity of the three R. oryzae strains in different years and fresh cultures were similar to that of the same year. In conclusion， the preservation time of R. oryzae using coarse grains as storage substrate could reach more than 8 years at 4～7 ℃ and the genetic stability was good.

Key words： Rhizopus oryzae， coarse grains， total sugar， enzyme activity， preservation time

米根霉是釀酒用曲药的主要糖化菌株，同时也是大曲中功能菌之一[1]，工业上还可用来生产淀粉酶[2]。根霉除有较强的糖化能力外，还具有一定的酒精发酵能力，但其酒精发酵能力比一般酵母弱得多，只能产生3%～5%的酒精度[3]；因此米根霉常作为生产小曲和甜酒酿的糖化菌种，另外它具有的产有机酸[4-6]的特性使酒的口感更香醇。菌株传代保存是相关科研生产单位的重要工作之一。大多数酒曲厂都是采用试管培养基转管传代的方法保藏菌种，由于频繁传代培养，又加上小企业无菌操作设施和技术限制，菌种极易染杂菌和变异退化，一般每年都要到科研机构或菌种保藏机构购买母种，有时买来的菌种只能保证是这个种，不一定能保证所需要的优良生产性能。如何长期有效地保藏性能优良的米根霉菌种让相关技术人员倍加关注。

目前真菌的保存方法主要有三类[7-8]：第一类是保持菌体连续生长的保藏方法，其特点是不断将菌株转接到新鲜培养基上，培养好后放在4～7 ℃冰箱中，此方法主要以斜面每2～3月转接一次为主[9-10]，因需要频繁传代，易变异退化，染上杂菌的机会也较多[11]；第二类是在缺氧干燥的空间中保藏菌种的休眠体，如孢囊孢子、分生孢子等，此法可保存1～2年，保存过程中需换干燥剂、抽真空1～2次，操作也较繁琐；第三类是通过抑制微生物的生长活性而达到长期保存目的，一般是低温冻藏，如真空冷冻干燥、液氮保存[12]及磁珠保藏[13]等，微生物可存活5～20年，弊端是设备贵、操作复杂[14-15]，特别是微生物细胞冷冻和解冻活化技术要求都较高，在处理过程中也难免存在因冷冻降温操作不慎导致冰晶对细胞造成的伤害问题，这也就是为什么有时企业从相关微生物保藏中心购买的冻干管菌种，活化转接后会失去菌株原本的生产能力甚至接不活的原因；瓷珠菌种保存管法，常用于食品微生物标准菌种和分离菌株的保存、复苏以及运输，保存效果次于冷冻真空干燥保藏法，也比较容易操作，但保存时间较短[13]。

现在真菌保藏技术研究多以提高菌株的存活率和纯度为衡量指标[16-17]，而忽视保持菌株的生产性能的稳定性。况且没有一种保藏方法能适合所有真菌的保藏，每一种真菌都应该有独特的保藏方法。本研究拟设计一种以混合粗粮为基质干燥冷藏保存根霉种的方法，将以该法保藏的不同年份的米根霉种及用其制备的新鲜菌种，用于发酵糯米，并测定糯米发酵液的糖度，以此来衡量该方法保存多年的根霉种的繁殖力和糖化力的稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要原料

麸皮、燕麦、藜麦、小米、玉米芯、糯米：市售。不同保藏年份的根霉种2-2、F14、F6：江西农业大学食品科学与工程学院微生物实验室保存。

1.1.2 主要药品

氢氧化钠、酚酞、醋酸、醋酸钠、五水硫酸铜、次甲基蓝、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾（均为分析纯）：天津市永大化学试剂开发中心；可溶性淀粉、葡萄糖（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。

1.1.3 主要仪器和设备

BCD-378DGN型冰箱：青岛海尔股份有限公司；HH-B11-600型电热恒温培养箱、GZXDH-DXO-S型电热恒温干燥箱：上海跃进医疗器械厂；SW-CJ-2D型超净工作台：江苏净化设备有限公司；MJ-54A型高压灭菌锅：施都凯仪器设备（上海）有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 保藏培养基制备

称取磨碎或粉碎玉米芯10%、燕麦片55%、小米20%、黎麦15%混合均匀，将上述原料混匀后放在65 ℃的烘箱内烘2 h，用粉碎机打碎；先过20目筛筛掉粗颗粒，再过40目筛筛掉细粉，取筛上物料，加入物料质量分数40%的海藻糖水溶液（含海藻糖8%），然后翻拌混匀至松散不结块状态即可。

1.2.2 根霉种保藏方法

将上述保藏培养基分装入250 mL三角瓶中，用棉塞塞好包扎灭菌后，趁热取出并将培养基拍散，冷却，分别接入分离纯化好的米根霉试管种F6、F14、2-2，然后于28～32 ℃恒温培养箱中培养40～48 h后，无菌操作在三角瓶内弄散后装入无菌牛皮纸信封中封好，于40～45 ℃恒温干燥箱（使用前干燥箱应紫外灯照射杀菌）中干燥36～48 h，干燥脱水后，用无菌塑料袋装好密封，放入2～7 ℃冰箱中保存3～9年。

1.2.3 转接制备新鲜根霉种

称取适量麸皮[18]，加入麸皮量40%～50%的水翻拌混匀至松散不结块状态，分装入250 mL三角瓶中，用棉塞塞好包扎灭菌后，趁热取出并将培养基拍散，冷却，分别接入不同保藏年份的根霉种F6、F14、2-2，然后于28～32 ℃恒温培养箱中培养40～48 h后，弄散装入灭菌过的牛皮纸信封中封好，于40～45 ℃恒温干燥箱中烘干36～48 h，用无菌塑料袋装好，放入2～7 ℃冰箱备用。

1.2.4 根霉种糖化力检测

将糯米洗净、浸泡3～4 h、沥干水，隔水蒸至米半透明内无白心，用纯净水淋冷至室温，均匀拌入0.5%～1.0%的根霉种，装入容器、压实，用保鲜膜封好，置于30 ℃恒温培养箱中糖化40～48 h，有酒香味及发酵液后，用糖度计测发酵液的糖度，以发酵液的糖度来反映根霉的糖化力。糖度越高，根霉的糖化力越强。

1.2.5 酸度测定

参考文献[19]。

1.2.6 糖化酶活力测定

参考文献[20]。

2 结果与分析

2.1 根霉菌株2-2保存时限探讨

2.1.1 不同年份2-2的糖化力及其酒液的酸度

根霉2-2是从贵阳花溪酒曲中分离到的一株生产和生长性能类似于经典根霉糖化菌Q303的菌株，在酿酒过程中不仅有很强的糖化能力，而且具有一定的酒精发酵能力[21]。将保存5～9年的2-2分别发酵糯米，以发酵液的糖度来反映其糖化力，以发酵液的酸度高低及是否有异味来确定保存的根霉种发酵的酒酿质量是否符合要求，从而得出根霉种可保存年限。根霉2-2发酵液的糖度见图1，酸度和风味见表1。

由图1可以看出，保存了5～9年的根霉种的糖度均在40～45 °Bx，当年糖度和目前糖度的差值不大，符合根霉种质量要求；保藏5年的有异味，可能是原种不纯或是操作性污染，重复几次后发现出现同样结果，由此可知是原种不纯。由表1可以看出，发酵液的酸度均未超过0.5%，在相关标准规定的范围内。由此可知，保存的根霉种的糖化力基本没有衰减。

2.1.2 用不同年份的2-2转接制备的新鲜种的糖化力及其酒液的酸度

为了检测所保藏种2-2的繁殖力及遗传稳定性，用保藏种2-2转接制备成新鲜麸皮根霉种，糖化发酵糯米40～45 h，测发酵液的糖度和酸度。保存5年的由于不纯，这步实验忽略。由图1可以看出，用保存3～9年的根霉转接制备的新鲜根霉种的糖化力均在42.0～46.8 °Bx，新鲜种与保藏种的差值在0.5～2.0，且高低互现，说明糖化力基本未随着保藏年份的增加而衰减，保持了優良的繁殖力和遗传稳定性。 由表2可以看出，发酵液的酸度都没超过0.5%，发酵液甜味纯正丰满，无明显酸感，均无异味，说明保存过程中未染杂菌。

综上所述，由燕麦皮、小米粉、藜麦粉等粗粮混合制备的保藏培养基培养的根霉种2-2干燥脱水后保存时限可达9年。

2.2 根霉菌F14保存时限的探讨

2.2.1 不同年份F14的糖化力及其酒液的酸度

多数根霉菌株的孢子囊成熟后呈黑色，由于这些黑色孢子囊（一般简称黑孢子）往往影响米粉酒饼的外观品质，许多酒厂和酒曲经销商不喜欢使用或经销外表有黑孢子的酒饼，所以一般只适合做麸曲或糠曲，不适合做酒饼。而用F14做出的酒饼不长肉眼可见的黑孢子，糖化发酵能力又较强，因此F14成为湖北、四川、广西等一些酒饼企业生产常用菌[22]。

用保存3～9年的F14发酵糯米，糖度见图2，酸度和风味见表3。

由图2可知，保存了3～9年的F14的发酵液糖度均大于44 °Bx，糖化力较高。由表3可知，发酵液的酸度较低，均小于0.37%，且发酵液均有蜂蜜的香甜味。由此确定，保存3～9年的F14的发酵特性未发生改变。

2.2.2 用不同年份的F14转接制备的新鲜种的糖化力及其酒液酸度

为了检测F14的繁殖力及遗传稳定性，将不同年份保藏种F14转接制备成新鲜麸皮种，用其发酵糯米，观测发酵液的糖度和酸度。由图2可以看出，用不同年份的F14转接制备的新鲜种的糖化力均在43～46 °Bx，说明糖化力基本上没有衰减。由表4可以看出，发酵液的酸度多数较低（低于0.24%），保藏6年的酸度虽高（0.35%），但口感反而更丰满；符合相关产品的质量要求，证明该方法保存9年的F14的糖化力和遗传稳定性依然很好。

2.3 根霉菌F6保存时限的探讨

2.3.1 不同年份F6的糖化力和及其酒液的酸度

F6是从广东肇庆传统小曲中分离得到的一株糖化能力较强的菌株，与Q303、2-2、F14相比，F6的孢子囊梗和菌丝更短，在麦芽汁培养基表面生长会起皱褶，气生菌丝稀疏，黑孢子很少。因此用其生产的酒饼不仅不长肉眼可见的黑孢子，还呈现悦目的淡黄色；且在糖化发酵中产生独特风味。 该菌种现已被广西、广东、海南等地的一些酒曲厂采用。F6与2-2、F14纯根霉曲相比，酿造的酒18种氨基酸总含量（1.7 g/100 mL）和人体8种必需氨基酸的总含量（0.53 g/100 mL）均更高[23]。

用不同年份的F6糖化发酵糯米，发酵液的糖度检测结果见图3，酸度和风味见表5。

由图3可以看出，保存2～8年的根霉F6，其糖度在36～40 °Bx，与当年的糖化力差别在范围内，酸度虽普遍比2-2和F14都更高，但均未超过0.5%，且风味醇香可口，符合企业标准。

2.3.2 用不同年份的F6转接制备的新鲜种的糖化力及其酒液的酸度

将保藏根霉种转接制备新鲜种，用其发酵糯米，测糯米发酵液的糖度和酸度，以衡量F6的繁殖力及遗传稳定性。由图3可知，用保存2～8年的F6转接制备新种的糖化力均在39～42 °Bx，均比保藏種高1.0～3.4 °Bx，说明保藏种F6经转接活化后使用酶活力更强，生产效率会更高，这可能与F6孢子少有关系，因为孢子抵抗不良生长环境的能力更强，菌丝经长时间的保存繁殖力比孢子要弱[24]。由表6可知，发酵液的酸度及风味与保藏种差不多，均未超过0.5%，在合格范围内，说明保存8年的 F6依然保持了良好的繁殖能力和糖化力。

综上所述，以混合粗粮为基质保藏的根霉F6的保存时限也可达8年。

2.4 糖化酶活力测定

为了验证上述糖化力测定方法的可靠性，从不同年份的2-2、F14、F6保藏种和转接制备的新鲜菌种中，各取1个糖化力最高的种，用还原法测定其糖化酶的活力，结果见图4。

由图4可以看出，所检测的菌种的糖化酶活力与直接发酵糯米测定的糖化力强弱顺序相吻合，说明本文使用的糖化发酵糯米的方法检测根霉种的糖化力是可靠的。

3 结 论

由粉碎的燕麦、小米、藜麦、玉米芯混合制备的保藏培养基制备的根霉种干燥脱水后保存时限可达8～9年。根霉2-2和F14直接应用保藏种与转接活化种发酵糯米的糖化力没有明显规律性的差别，但F6使用前将保藏根霉种转接活化后其糖化酶活力均更高。

保藏种可随取随用，每次从冷藏冰箱取用时只需先回温至常温，再打开封口就可直接用于制备2级种；而试管和冷冻管菌种须活化1～2代，再扩培后，才能用于制备2级种。从活化、扩培到制备2级种至少要再传2～4代[25-26]，用本方法的保藏种制备2级种只需传1～2代。

本研究中4种保藏培养基组分玉米芯、燕麦、小米、藜麦各有功能。其中，玉米芯是玉米棒剥掉玉米粒的废弃物粉碎而成的，在培养基组成中不作为根霉菌的营养组分，只起疏松透气和固定化作用；藜麦淀粉含量虽很低，但含30%的胚芽，蛋白质、皂甙和多酚含量均比其它谷物高，抗氧化能力较强，其蛋白含量丰富且比例平衡，含有全部天然氨基酸，是联合国粮农组织推荐的唯一全营养食品[27]，是作为本文保藏培养基的保健组分；小米含有其它原料中没有的胡萝卜素，维生素B1的含量居其它谷物之首，此外小米的钙含量也较高且仅次于燕麦[28]，钙是许多生物酶的激活剂，在保藏方法中小米对根霉起复壮作用；燕麦是该保藏培养基的基本营养组分。综上所述，该保藏培养基中4种原料相辅相成，各有其重要功能。

该保种方法：操作简单，对设备要求低，保藏时间长，保存量大，保存菌种的糖化力稳定，对于一般酒曲企业和酒厂，尤其是个体户是一项很实用的保种技术，对酿造工业用种质资源的可持续发展也有重要意义。后续将对保藏8～9年的3个种进行产糖化酶基因测序，并与用试管频繁转管保藏种的酶基因对比，观察其相关遗传基因是否有变化。

参 考 文 献

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