基于可培养技术的中国家用洗衣机中真菌多样性研究

曹运奕 张晶晶 高源 陈剑 康佳丽 姚粟

摘 要：本文通过可培养方法分析中国家用洗衣机中的真菌多样性，采用不同培养基对洗衣机不同位置的真菌进行分离，通过序列分析进行鉴定。结果表明从14台洗衣机的57个样品中共分离获得真菌253株，涵盖36个属。洗衣机中优势真菌主要有青霉属（Penicillium）、枝孢菌属（Cladosporium）、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、紫霉属（Purpureocillium）等。研究结果为洗衣机中具有致味、致污、致病和抗逆功能的特征微生物的定向筛选、抗菌抑菌试验的开展以及作用机制的研究奠定了基础。

关键词：洗衣机，真菌多样性，可培养方法

DOI编码：10.3969/j.issn.1002-5944.2023.05.037

0 引 言

洗衣机是现代家庭必不可少的家用电器，保有量逐年增加[1]。在全球倡导“健康环保”大背景下，叠加新冠疫情影响，消费者健康需求不断升级，“健康洗护”功能开发成为行业提速发展的主赛道[2-4]。由于洗衣机存在内环境潮湿、内筒和外筒夹层存在大量污垢、消毒管理频率低等问题，造成洗衣机内部微生物的大量滋生，引起衣物的二次污染，甚至成为致病微生物传播的载体，进而增加人们感染疾病的风险[5-7]。围绕洗衣机长时间使用存在的潜在微生物污染问题，全面开展家用洗衣机微生物群落状况调研，将为推动洗衣机抗除菌技术实现专业化、细分化升级，构建科学、健康的洗护生态环境奠定基础[8，9]。

目前，平板培养法仍然是研究洗衣机内微生物的主要方法。Jacksch等人[10]采集了洗衣机洗涤剂抽屉和门封圈样品，发现洗衣机内平均生物量为2.1±1.0×104 CFU/cm2，门封圈顶部的生物量为11.1±9.2×101 CFU/cm2。Gattlen等人研究表明，以培养法分离出的真菌达上百种，包括近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis），曲霉属（Aspergillus），枝孢菌属（Cladosporium），胶红酵母（Rhodotorulamucilaginosa）等[11，12]。李炎等人[13]研究发现115份洗衣机洗涤水水样中真菌菌落总数平均为2.3×102CFU/mL。Tischner Z等[14]人对来自匈牙利的61台洗衣机的门封圈、料盒（洗衣粉、柔顺剂）开展真菌的分离研究，共分离得到71株真菌，其中32株属于酵母菌，39株属于丝状真菌，枝孢霉属（Cladosporium）、镰刀菌属（Fusarium）、青霉菌属（Penicillium）、红酵母属（Rhodotorula）均为优势分离菌属。综上所述，洗衣机内部存在潜在的微生物污染风险，但是目前我国在这方面的研究鲜有报道。

因此，本研究基于可培养技术系统开展了我国家用洗衣机真菌多样性分析，旨在探究洗衣机内部不同位点的可培养真菌多样性，分离一批优势的真菌微生物菌株，为后期定向筛选洗衣机中具有致味、致污、致病和抗逆功能的特征微生物资源奠定基础，为洗衣机抗菌、抑菌试验的开展以及抗菌材料的开发提供研究基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

生物安全柜（ESCO AC2-6S1 CLASS II TYPEA 2）；隔水式培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；高速冷冻离心机（5424 R），德国Eppendorf 公司；PCR仪（TRIO48），德国Biometra公司；微量核酸蛋白分析仪（BioDrop-μLite），英国Biochrom有限公司；电泳仪（EC250-90），美国BIO-RAD公司；恒温培养箱（GHP-9160），上海一恒科学仪器有限公司；测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。

1.2 材料

麦芽提取粉琼脂（MEA），马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），均购自北京陆桥技术股份有限公司；氯硝胺甘油琼脂培养基（DG-18），购自海博科技有限公司；真菌DNA提取试剂盒，磁珠组织DNA提取试剂盒购自美国Omega Bio-Tek公司；PCR MasterMix，DL2000 Marker购自北京全式金生物技术有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

本研究收集了来自北京、广州、青岛、无锡地区共14台在使用期的波轮和滚筒洗衣机作为研究对象，详细信息见表1。每台洗衣机设置5个采样位点，包括洗衣机的门封圈、料盒、内筒外壁、外筒内壁和下水口，共采集57份样品。参考GB/T 18204.4-2013《公共场所卫生检验方法 第4部分：公共用品用具微生物》[15]对洗衣机的待采样部位进行了采样：使用无菌干燥棉拭子，于5mL灭菌生理盐水内浸润，在洗衣机的待采样部位均匀涂抹进行样品的采集，用灭菌剪刀剪去棉签手接触部位，将棉拭子放入剩余的生理盐水内，制备成待检样品。

1.3.2 样品中可培养真菌的分离纯化

洗衣机采集的样品以10倍梯度逐级稀释，制得1∶10和1∶100的样品悬液，分别吸取100μL原液和稀释液涂布于PDA、MEA、DG18培養基上，每种培养基涂布两个平板，分别放置于28℃和20℃，好氧培养3-10d。选取培养基上形态特征不同的菌落进行纯化和计数。

1.3.3 样品中可培养真菌的菌种鉴定

利用真菌基因组提取试剂盒提取分离菌株的DNA，再利用核糖体翻译间隔序列（ITS）、核糖体rDNA大亚基（26S D1/D2）[16]等分子标记引物对丝状真菌和酵母菌的核酸序列进行PCR扩增。PCR扩增体系：2×PCR MasterMix 21μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，DNA 30ng，ddH2O补足至50μL。PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 45s，72℃45s，共27个循环；72℃ 10min[17 ]。扩增后获得约600bp的DNA片段，并进行测序。根据测序结果，用菌株的26S rDNA和ITS基因作为靶序列，在GenBank数据库中用BLAST程序搜索同源序列，挑选与靶序列最相近的参考菌株系列，以97%序列相似性为判定标准完成菌种鉴定。

2 结果与分析

2.1 不同采样位置真菌分离结果分析

从14台洗衣机的不同采样位置共分离得到253株真菌，其中，下水口分离到的菌株数量最多，分离到63株真菌；内筒外壁和外筒内壁次之，分别分离到61株和55株真菌；料盒和密封圈分别分离到42株和32株。洗衣机不同采样位点优势真菌详见表2。在优势真菌中，木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）菌株易形成生物被膜，赭霉属（Ochroconis）菌株可从人体呼吸道、表皮组织中分离出，对人类健康具有潜在影响；枝孢菌屬（Cladosporium）、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）的部分菌株具有致病性；内筒外壁和外筒内壁不易清洁，在清洗过程中微生物可能间接污染衣物，需要重点防控相关致病菌的产生；洗衣机的料盒主要是洗涤剂存放处，若污染真菌，会随洗衣液污染衣物。

在洗衣机的5个采样位点中，洗衣机不同采样位置有6个共有菌属（详见图1），分别为青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、枝孢菌属 （Cladosporium）、木霉属（Trichoderma）、紫霉属（Purpureocillium），说明这几类真菌在洗衣机不同位点中广泛分布，是洗衣机真菌污染重点关注的菌种。洗衣机不同位点分布的真菌具有一定的差异性，洗衣机下水口、内筒外壁和外筒内壁分离到的特有菌属较多，推测可能由于内筒外壁和外筒内壁与下水口直接接触衣物和污水，且潮湿不易清洁，因而菌株多样性丰富。

2.2 不同地理位置真菌分离结果分析

通过对不同城市分离菌株的数据进行统计分析发现，无锡地区分离到的菌株数量最多，总共分离到82株；北京次之，分离到70株；青岛和广州分别分离到53株和48株。洗衣机不同地理位置优势真菌详见表3。洗衣机不同地理位置有3个共有菌属，详见图2，分别为青霉属（Penicillium）木霉属（Trichoderma）、紫霉属（Purpureocillium）。这三个属的菌株在洗衣机不同位点中也均有分布，表明这三类菌在洗衣机中易传播，且环境适应性较强，可在后续研究中重点关注。

为进一步研究不同地域对洗衣机中微生物多样性的影响，将北京和青岛作为北方代表城市，无锡地区和广州作为南方代表城市进行分析。北方总共分离到12 3株，南方总共分离到13 0株。北方样品分离频次前五的菌种分别为青霉属（Penicillium）、镰刀菌属（Fusarium）、曲霉属（Aspergillus）、紫霉属（Purpureocillium）和赭霉属（Ochroconis），北方地区中青岛滚筒分离到的菌株数最多；南方样品分离频次前五的菌种分别为青霉属（Penicillium）、紫霉属（Purpureocillium）、枝孢菌属（Cladosporium）、曲霉属（Aspergillus）和木霉属（Trichoderma），南方地区广州滚筒分离到的菌株数最多。综上所述，青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、紫霉属（Purpureocillium）、枝孢菌属（Cladosporium）为不同地域洗衣机中的共同优势菌，其中青霉属（Penicillium）是两个地域分离频次均最高的菌属。

2.3 洗衣机中优势真菌的特性分析

基于可培养技术分离筛选洗衣机中特征性微生物，结合不同地域、不同采样位置中微生物的分布以及生物学特性，分析造成洗衣机使用过程中异味、生物膜等问题的关键微生物，筛选出的关键真菌微生物类群主要为青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、枝孢菌属（Cladosporium）、镰刀菌属（Fusarium）、紫霉属（Purpureocillium）、假丝酵母属（Candida）和赭霉属（Ochroconis）等。其中，枝孢霉属（Cladosporium）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、赭霉属（Ochroconis）均为多篇文献通过可培养分离得到的菌株，木霉属（Trichoderma）和紫霉属（Purpureocillium）、黑酵母属（Aureobasidium）、毛壳菌属（Chaetomium）等为本研究从洗衣机中分离到的特有菌株。

青霉属（Penicillium）在腐烂的水果、蔬菜、肉类和各种潮湿的有机物上常见[18，19]，洗衣机中环境较为潮湿，容易滋生青霉。该属部分种可引起角膜、皮肤、外耳、呼吸道、泌尿系统感染，以及人工瓣膜植入后发生的心内膜炎。已有文章报道，青霉在严重免疫功能低下患者中引起播散性疾病，许多菌株产生真菌毒素[20]。曲霉属（Aspergillus）在自然界分布广泛，可分离自空气、土壤、腐败食物和临床呼吸道组织，37℃生长，可侵害家禽、家畜甚至人体内脏特别是呼吸道器官，菌丝体发达可形成生物膜[21]。枝孢菌属（Cladosporium）也是非培养结果中分离到的关键菌种，可形成生物膜，部分种可引起角膜炎，可广泛引起哮喘病人或有类似呼吸系统疾病患者的过敏反应[22]。镰刀菌属（Fusarium）中有些种可产生玉米赤酶烯酮、T-2毒素、呕吐毒素等对人和动物有强烈毒性的真菌毒素，可引起人体心血管、食管癌、角膜溃疡等疾病，污染粮食、蔬菜和饲料，人畜误食会中毒，镰刀菌菌丝体发达可形成生物膜，具有致污特性[23]。紫霉属（Purpureocillium）在不同位点和不同地域均有被分离到，菌株生长速度较快，能快速产生孢子，广泛存在于土壤和空气中，可导致皮肤感染[24]。假丝酵母属（Candida）可形成生物膜，导致菌血症，可感染免疫力低下的病人和其他动物[25]，导致鹅口疮症。赭霉属（Ochroconis）也是非培养结果中分离到的关键菌种，可能导致真菌病[26]。

3 结 论

本研究选取14台洗衣机，通过可培养方法共分离获得真菌253株，涵盖36个属，97个种。洗衣机中的优势真菌主要有青霉属（Penicillium）、枝孢菌属（Cladosporium）、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、紫霉属（Purpureocillium）等。分离到的优势菌属中，青霉属（Penicillium）、枝孢菌属（Cladosporium）、紫霉屬（Purpureocillium）和曲霉属（Aspergillus）在自然界分布极广。青霉属（Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）是引起多种物质霉腐的主要微生物。青霉属（Penicillium）、枝孢菌属（Cladosporium）、曲霉属（Aspergillus），这三个属的菌株在洗衣机中易传播，且环境适应性较强，可作为洗衣机中重点关注菌属。紫霉属（Purpureocillium）和木霉属（Trichoderma）在不同位点和不同地域均有被分离到，这两类菌株生长速度较快，且能快速产生孢子，易传播，属于临床常见报道的风险菌种，后续需进一步跟踪研究。按照洗衣机的不同采样位置和不同地理位置，对洗衣机中分离真菌的多样性进行了分析。洗衣机不同采样位置的材质和结构不同，真菌种类具有一定的特异性，下水口和内筒外壁相较于其他位置分离到的真菌株数较多；南方城市的洗衣机分离到的真菌数量多于北方城市。针对洗衣机的真菌污染情况应加强关注，一方面研究新型抗菌材料，减少洗衣机中微生物的附着和增殖；另一方面应建立良好的使用习惯，定期对洗衣机清洁消毒，以减少微生物污染。研究结果为洗衣机中具有致味、致污、致病和抗逆功能的特征微生物的定向筛选、抗菌抑菌试验的开展、关键特征微生物的作用机制的研究以及抗菌材料的开发奠定了基础。

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作者简介

曹运奕，博士，工程师，研究方向为家电微生物。

姚粟，通信作者，博士，教授级高级工程师，研究方向为工业微生物。

（责任编辑：张佩玉）