引痰方穴位贴敷涌泉穴对卵清蛋白诱导哮喘小鼠气道炎症的影响

2023-02-03赵海东喻闽凤解换弟陈立红

广州中医药大学学报 2023年1期

赵海东，喻闽凤，解换弟，陈立红

（广州中医药大学第四临床医学院，广东深圳 518000）

支气管哮喘（简称哮喘）是多种炎症细胞和细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病，多由于接触变应原后产生气道高反应，引起反复发作的喘息、气促、胸闷、咳嗽等症状，是威胁公共健康最常见的慢性肺部疾病，儿童哮喘以男孩多发，存在遗传的可能[1]。吸入糖皮质激素（ICS）是目前作用靶点最广、效应最强的哮喘治疗药物，不仅作为首选长期控制药物，也是使用速效支气管舒张剂缓解哮喘症状时的联合用药[2]。但由于哮喘病程长及ICS依从性差、吸入方法错误等原因，常导致儿童哮喘控制不佳，尤其是3～5岁年龄阶段的患儿[3]。穴位贴敷是中医常用的外治法之一，因其疗效良好、经济方便、不良反应小，被家属及患儿广泛接受。课题组前期临床研究显示，引痰方贴敷涌泉穴治疗在改善哮喘患儿呼吸频率、减轻临床症状及体征、促进胸部X射线吸收等方面的疗效显著[4]；但其具体作用机制尚不明确。因此，本研究以卵清蛋白（OVA）哮喘小鼠为研究对象，进一步观察引痰方穴位贴敷双侧涌泉穴对哮喘小鼠气道炎症的影响，探讨其作用机制，以期为临床应用引痰方穴位贴敷双侧涌泉穴治疗哮喘提供科学依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物70只SPF级雌性BALB/c小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g，由珠海百试通生物科技有限公司提供，动物使用许可证号：SYXK（粤）2018-0014，实验动物质量合格证号：44822700003780。设施合格证号：00281725。动物实验方案已通过深圳市中医院医学伦理委员会审查批准。

1.2 药物、试剂与仪器引痰方（外用，由明矾、皂荚、牵牛子按质量分数1∶1∶1比例磨粉后姜汁调和而成），由深圳市中医院提供，批号：20210720，规格：1 kg/袋；吸入用布地奈德混悬液（AstraZeneca Pty Ltd.，规格：2 mL∶1 mg，批号：327314）；凡士林（大连美仑生物技术有限公司，批号：J0603A）；卵清蛋白（美国Sigma公司，批号：SLCB8249）；氢氧化铝佐剂（美国赛默飞世尔科技有限公司，批号：WF322465）；乌拉坦（上海源叶生物科技有限公司，批号：Z10O11Y126927）。小鼠白细胞介素（IL）-17、IL-11、IL-13，小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（江苏酶免实业有限公司）。酶标仪（美国赛默飞世尔科技有限公司，型号：Multiskan FC）；多功能诱咳引喘仪（深圳市长庚医用物资有限公司广州分公司，型号：YLS-8A）。

1.3 造模方法[5-8]致敏液制备：将20 mg OVA加入1 mL生理盐水，充分溶解后，取0.4 mL加入9.6 mL生理盐水，混匀，取与该液体等体积的氢氧化铝佐剂混合，摇匀30 min后使用。激发液制备：500 mg OVA加入10 mL的生理盐水中，充分溶解后使用。哮喘模型构建：第0、7、14天给予小鼠腹腔注射致敏液0.2 mL/只，第24～26天以激发液10 mL雾化吸入，40 min/d。若小鼠出现张口喘息、腹部翕动、易激惹、烦躁不安，且出现喷嚏频频，饮水增多，表明造模成功。正常对照小鼠在第0、7、14天给予0.2 mL生理盐水代替致敏液，第24～26天给予生理盐水10 mL雾化吸入，40 min/d。

1.4 分组与干预将70只小鼠适应性饲养后，选取12只作为正常对照组，饲喂普通饲料；其余58只设为造模组，饲喂普通饲料，同时构建哮喘模型。将造模成功的48只小鼠随机分为模型对照组、凡士林穴位贴敷组、引痰方穴位贴敷组和布地奈德雾化组，每组12只。穴位选择：根据华兴邦等[9]研制的大鼠穴位图谱，涌泉穴位于后肢掌心前正中。引痰方穴位贴敷组：用胶布固定引痰方贴剂外用于双侧涌泉穴，每日1次，每次6 h，连续治疗2周。凡士林穴位贴敷组：用胶布固定凡士林贴剂外用于双侧涌泉穴，每日1次，每次6 h，连续治疗2周。布地奈德雾化组：给予布地奈德雾化治疗，每次0.5 mg，每次雾化10 min，每日上午、下午各1次，连续治疗2周。正常对照组和模型对照组：给予无菌注射用水雾化治疗，每次2 mL，每次雾化10 min，每日上午、下午各1次，连续雾化2周。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 支气管肺泡灌洗液（BALF）炎症细胞计数给药结束后，结扎小鼠一侧肺组织，另一侧进行灌洗，得到支气管肺泡灌洗液，显微镜下进行炎症细胞和嗜酸性粒细胞计数，并计算嗜酸性粒细胞占比。

1.5.2 ELISA法检测肺组织匀浆液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量取肺组织（约45 mg）加入300 μL RIPA裂解液（其中含有1 mmol/L的PMSP和1×蛋白酶抑制剂PhosSTOP）充分匀浆，按照IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α的ELISA试剂盒说明书操作。

1.5.3 苏木素-伊红（HE）染色法观察肺组织病理学变化取右肺组织置于4%甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋、切片和HE染色，显微镜下观察其病理变化。

1.5.4 气道及其周围炎症评分根据既往文献研究[10-11]，针对气道及其周围炎症细胞浸润情况进行评分。具体评分细则见表1。

表1 炎症评分标准Table 1 Inflammation scoring criteria

1.6 统计方法采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，所有数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比较采用LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠生物行为变化比较在整个实验过程中：正常对照组小鼠活动正常，毛发色泽光亮，体质量逐渐增加；模型对照组及各治疗组哮喘小鼠饮食少，毛色灰暗，发育迟缓。

在雾化激发过程中，前期观察到模型对照组及各治疗组哮喘小鼠出现抓鼻、躁动不安，呼吸急速深快，后期活动减少、嘴唇紫绀、聚集成堆、大便增多等异常症状，而正常对照组小鼠无上述异常症状，说明哮喘造模成功。

药物干预后，引痰方穴位贴敷组和布地奈德雾化组哮喘小鼠活动增加，哮喘行为变化减轻。

2.2 各组小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞水平比较表2结果显示：与正常对照组比较，模型对照组和凡士林穴位贴敷组小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞总数明显增加，嗜酸性粒细胞数量及占比明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型对照组比较，引痰方穴位贴敷组和布地奈德雾化组小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞总数和嗜酸性粒细胞数量及占比显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；引痰方穴位贴敷组小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞总数和嗜酸性粒细胞数量及占比与布地奈德雾化组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞总数和嗜酸性粒细胞数量及占比比较Table 2 Comparison of the total number of inflammatory cells and the number and proportion of eosinophils in the bronchoalveolar lavage fluid among various groups of mice （±s）

注：①P＜0.01，与正常对照组比较；②P＜0.01，与模型对照组比较

组别正常对照组模型对照组凡士林穴位贴敷组引痰方穴位贴敷组布地奈德雾化组鼠数/只6 6 6 6 6炎症细胞总数/（×104个·mL-1）18.67±3.01 71.83±4.79①73.83±7.78①27.50±3.94②18.83±4.12②嗜酸性粒细胞数量/（×104个·mL-1）0.28±0.36 45.26±7.42①48.92±9.13①5.70±2.63②2.60±1.96②嗜酸性粒细胞占比/%0.01±0.02 0.63±0.09①0.66±0.08①0.20±0.06②0.13±0.07②

2.3 各组小鼠肺组织匀浆液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量比较表3结果显示：与正常对照组比较，模型对照组和凡士林穴位贴敷组小鼠肺组织匀浆液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型对照组和凡士林穴位贴敷组比较，引痰方穴位贴敷组和布地奈德雾化组小鼠肺组织匀浆液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；引痰方穴位贴敷组IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量与布地奈德雾化组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组小鼠肺组织匀浆液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量比较Table 3 Comparison of IL-17，IL-11，IL-13 and TNF-α levels in lung tissue homogenate among various groups of mice （±s，pg·mL-1）

注：①P＜0.01，与正常对照组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型对照组比较

组别正常对照组模型对照组凡士林穴位贴敷组引痰方穴位贴敷组布地奈德雾化组鼠数/只6 6 6 6 6 IL-17 37.49±1.34 41.88±2.57①41.59±1.34①38.49±1.51③37.97±1.20③IL-11 75.66±4.19 83.74±4.63①83.61±3.88①77.24±2.99②76.04±5.83③IL-13 50.85±1.71 58.04±2.80①57.71±2.61①54.34±1.57③55.41±2.02②TNF-α 453.07±10.21 491.01±27.36①491.29±14.00①459.40±44.48②457.96±9.02②

2.4 各组小鼠气道及其周围的炎症评分比较表4结果显示：与正常对照组比较，模型对照组和凡士林穴位贴敷组小鼠气道及其周围的炎症评分增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；引痰方穴位贴敷组和布地奈德雾化组小鼠气道及其周围的炎症评分较模型对照组和凡士林穴位贴敷组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；引痰方穴位贴敷组炎症评分与布地奈德雾化组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组小鼠气道及其周围的炎症评分比较Table 4 Comparison of inflammation scores in and around the airways among various groups of mice（±s，分）

注：①P＜0.01，与正常对照组比较；②P＜0.01，与模型对照组比较

组别正常对照组模型对照组凡士林穴位贴敷组引痰方穴位贴敷组布地奈德组鼠数/只6 6 6 6 6炎症评分0.67±0.52 3.17±0.75①3.50±0.55①2.50±0.55②2.17±0.75②

2.5 各组小鼠肺组织病理学变化比较图1结果显示：正常对照组小鼠气道壁厚度正常，可见散在炎症细胞、管腔无狭窄。与正常对照组比较，模型对照组和凡士林穴位贴敷组哮喘模型小鼠肺组织可见支气管上皮细胞肿胀、部分脱落，基底膜增生、变厚，可见大量炎症细胞浸润，以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主。引痰方穴位贴敷组和布地奈德雾化组肺组织损伤较模型对照组和凡士林穴位贴敷组明显减轻。

图1 各组小鼠肺组织病理学变化比较（HE染色）Figure 1 Comparison of histopathological changes in the lung tissue among various groups of mice（HE staining）

3 讨论

哮喘归属于中医学“哮证”“喘证”的范畴。哮喘最早记载于《黄帝内经》。《症因脉治·哮病》云：“哮病之因痰饮留伏，结成窠臼。”强调了痰邪对哮喘的影响。《证治汇补·哮病》中所述：“哮即痰喘之久而常发者，因内有壅塞之气，外有非时之感，膈有胶固之痰，三者相合，闭拒气道，搏击有声，发为哮病。”强调了气机不畅、外感时邪、痰阻气道是哮喘发病的主要病机[12]。引痰方源自清代陈复正《幼幼集成》，由明矾、皂荚、牵牛子组成，1∶1∶1等分研成细末，姜汁调和，贴敷涌泉穴。方中：明矾能祛除风痰；皂荚辛温通利气道，咸能软化胶结之痰；牵牛子能泻肺气，逐痰饮。三药合用共奏祛痰之效。涌泉穴为足少阴肾经之根，足少阴肾经起始之井穴，是足少阴肾经经气所出之处，既可交通阴阳，又能络脾入肺，使药力循经，直达肾脾肺，调其功能，补其虚损，达到阴阳平衡的状态[4]。故明矾、皂荚、牵牛子外敷足少阴肾经之涌泉穴具有祛痰平喘、纳气归元之功。

气道炎症是哮喘的主要病理学基础，多种炎症细胞聚集，释放炎症介质引起气道重塑以及免疫反应是本病发生的主要原因。有研究[13-18]表明，IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α被活化后能够激活上皮细胞、巨噬细胞等释放粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和相关细胞因子，引起气道内炎症细胞聚集，进一步促进气道炎症反应。本研究结果显示，与正常对照组比较，模型对照组和凡士林穴位贴敷组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞总数明显增加，嗜酸性粒细胞数量明显增多，肺组织匀浆液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量显著升高，肺组织可见支气管上皮细胞肿胀、部分脱落，基底膜增生、变厚，可见大量炎症细胞浸润，其中以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主。表明小鼠哮喘发作时大量炎症细胞参与，气道炎症明显。引痰方干预后OVA哮喘小鼠BALF中炎症细胞总数和嗜酸性粒细胞数量显著下降，肺组织匀浆液IL-17、IL-11、IL-13、TNF-α含量显著下降，表明引痰方贴敷双侧涌泉穴可通过减少炎症细胞浸润、抑制炎症因子水平，减轻炎症反应及气道重塑，达到治疗哮喘的效果，且治疗效果与布地奈德雾化疗效相当。

综上所述，引痰方穴位贴敷涌泉穴能够抑制OVA哮喘小鼠气道炎症因子释放，减轻炎症反应，控制哮喘发作，疗效与布地奈德雾化相当。