原儿茶酸对子宫内膜异位症大鼠炎症反应及血管生成的作用机制研究

潘 敏， 王晓莉， 胡 婷， 付 琼， 殷金凤， 黄超林

(1.四川省成都市第二人民医院， 四川 成都 610000 2.成都医学院第一附属医院， 四川 成都 610000)

子宫内膜异位症(heterotopia endometriosis，EMS)为子宫内膜腺体或间质在子宫外腔的沉降，与不规则子宫出血、不孕、性交困难和慢性盆腔疼痛相关[1]。5-50%的有生育问题的夫妇会患该病，10-20%的育龄妇女患有该病[2,3]。虽然该病在女性中很常见，但是目前对子宫内膜异位症的病因和病理生理学的了解尚不清楚。现存在几种不同的学说来解释子宫内膜异位症的发病机制，其中逆月经理论是认可度最高的理论，即子宫内膜细胞在月经期间通过输卵管回流到腹膜腔，植入并启动子宫内膜异位病变的形成[4]。因此，根据其发病机制寻找有效的治疗药物对患者的康复非常有意义。原儿茶酸(Protocatechuic acid，PA)是一种天然酚酸，广泛存在于日常的饮食和中草药[5]。近年来，现代药理学对原儿茶酸的药理活性进行了大量研究，其具有广泛的药理活性，如抗氧化、抗炎、神经保护、抗菌、抗病毒、抗癌、抗骨质疏松、镇痛、抗衰老等活性，具有保护肝脏、肾脏和生殖功能的作用[6]。近期有研究报道[7]，原儿茶酸通过抑制氧化应激、炎症反应和细胞凋亡，改善呋喃暴露大鼠下丘脑-垂体-性腺轴功能的缺陷。推测原儿茶酸可能对子宫内膜异位症的治疗也有一定作用。因此本研究拟建立子宫内膜异位症大鼠模型，观察原儿茶酸对模型大鼠子宫内膜损伤、炎症反应的影响，揭示其与ERK/VEGF/MMP通路之间的联系。

1 材料与方法

1.1药物与试剂:原儿茶酸(北京百灵威科技有限公司，批号：2954-52-1)、孕三烯酮胶囊(北京紫林药业有限公司，国药准字H19980020)、蛋白提取试剂盒(批号：P0027)及BCA试剂盒(批号：P0011)(上海碧云天公司)、兔源GAPDH抗体、羊抗兔二抗、抗鼠基质金属蛋白酶2(MMP-2)抗体、基质金属蛋白酶9(MMP-9)抗体、血管内皮生长因子(VEGF)抗体、血管生成素 1(Ang-1)抗体、血管生成素 2(Ang-2)抗体、总细胞外信号调节激酶(t-ERK1/2)及磷酸化总细胞外信号调节激酶(p-ERK1/2)抗体(美国Santa Cruz公司)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)及白介素1β(IL-1β)ELISA检测试剂盒(北京沃莱士生物科技有限公司)。

1.2实验动物:选择动情期、未生育SPF级SD大鼠54只，均为雌性，体质量(220±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物使用许可证SYXK(京)2017-0033。SD大鼠均饲养环境保持安静、整洁、通风，温度约25℃，自由饮食，定期更换垫料，对鼠笼清洁、消毒。

1.3模型建立:参考王金霞[8]等的方法，通过自体移植法建立EMS大鼠，将雌性成年大鼠(未生育)腹腔注射5%水合氯醛进行麻醉，剂量为0.07mL/kg。麻醉大鼠后，常规术前消毒，切开下腹部暴露子宫，挑离右侧子宫角，切除约1cm子宫段，取5mm×5mm大小的子宫内膜片，使其表面上皮对着腹壁，将四角与腹壁肌肉缝合，然后常规关腹，青霉素预防感染。大鼠常规饲养，自由饮水及进食。术后4周移植物外观隆起透亮小包，表面有血管，内部充满积液。移植的子宫内膜成活并沿腹壁表面再生，提示建模成功。

1.4分组处理:选取EMS模型大鼠54只随机均分为6组，包括空白组、模型组、孕三烯酮组0.5mg·kg-1·d-1、PA(高、中、低)剂量组(剂量分别为1.5mg·kg-1·d-1、1mg·kg-1·d-1及0.5mg·kg-1·d-1)，另取9只正常大鼠作为正常组。PA各个剂量组和孕三烯酮组每天灌胃给药1次，模型组每天给予等量生理盐水灌胃，连续给药28d。

1.5指标检测

1.5.1大鼠异位子宫内膜体积测量及标本采集:造模8周后，开腹观察异位子宫内膜生长情况，测量体积，记为V1，缝合腹部，以药物灌胃治疗7d，末次给药24h后，再次开腹观察异位子宫内膜生长情况，测量体积，记为V2，计算大鼠的病灶体积。 末次给药结束24h后，静脉采血3mL，各组大鼠尾静脉取血约3mL，4℃静置过夜，2000rpm/min转速，离心15min，取上清液，备用。处死大鼠，抽取腹腔积液3mL；剖取子宫，生理盐水洗净血污后，剪取1g组织，备用。

1.5.2ELISA检测腹腔液炎性因子:取出上清液，使用TNF-α、IL-6及IL-1βELISA试剂盒检测大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平，具体操作参照说明书步骤。

1.5.3Western blot检测子宫内膜组织Ang-1、Ang-2、t-ERK1/2、p-ERK1/2、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达:取2.4.1冻存子宫组织约0.3 g，使用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度后，各组分别取20μg蛋白样品进行电泳。再将分离蛋白转膜至硝酸纤维膜，根据目的蛋白的相对分子质量截取目的蛋白，进行蛋白标记。加入5%的脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入Ang-1、Ang-2、t-ERK1/2、p-ERK1/2、VEGF、MMP-2和MMP-9一抗溶液(1∶1000)，4℃孵育过夜，使用TBST漂洗3次，加入羊抗兔二抗溶液，室温孵育2h。凝胶成像仪采集图像，Image J软件分析蛋白的相对表达量。

1.6统计学处理:实验数据使用SPSS26.0分析。符合正态分布且方差齐的多组数据使用方差分析联合LSD-t检验，P<0.05表示差异有统计意义。

2 结 果

2.1原儿茶酸对大鼠子宫内膜异位症病灶体积的影响:与空白组比较，模型组大鼠第14、42d的病灶体积显著升高；与模型组相比，原儿茶酸低剂量组、原儿茶酸中剂量组、原儿茶酸高剂量组、孕三烯酮组大鼠第14、42d的病灶体积显著降低(P<0.05)。与原儿茶酸低剂量组相比，原儿茶酸中剂量组、原儿茶酸高剂量组、孕三烯酮组大鼠第14、42d的病灶体积显著降低(P<0.05)；与原儿茶酸中剂量组相比，原儿茶酸高剂量组、孕三烯酮组大鼠第14、42d的病灶体积显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 原儿茶酸对大鼠子宫内膜异位症病灶体积的影响

2.2原儿茶酸对大鼠子宫内膜异位症腹腔液炎症因子的影响:与空白组比较，模型组大鼠腹腔液炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β均显著升高；与模型组相比，原儿茶酸低剂量组、原儿茶酸中剂量组、原儿茶酸高剂量组、孕三烯酮组大鼠腹腔液炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β均显著降低(P<0.05)。与原儿茶酸低剂量组相比，原儿茶酸中剂量组、原儿茶酸高剂量组、孕三烯酮组大鼠腹腔液炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β均显著降低(P<0.05)；与原儿茶酸中剂量组相比，原儿茶酸高剂量组、孕三烯酮组大鼠腹腔液炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β均显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 原儿茶酸对大鼠子宫内膜异位症腹腔液炎症因子的影响

2.3原儿茶酸对大鼠子宫内膜异位症子宫内膜组织Ang-1和Ang-2蛋白表达的影响:与空白组比较，模型组大鼠子宫内膜组织Ang-1、Ang-2蛋白表达均显著升高；与模型组相比，原儿茶酸低剂量组、原儿茶酸中剂量组、原儿茶酸高剂量组、孕三烯酮组大鼠子宫内膜组织Ang-1、Ang-2蛋白表达均显著降低(P<0.05)。与原儿茶酸低剂量组相比，原儿茶酸中剂量组、原儿茶酸高剂量组、孕三烯酮组大鼠子宫内膜组织Ang-1、Ang-2蛋白表达均显著降低(P<0.05)；与原儿茶酸中剂量组相比，原儿茶酸高剂量组、孕三烯酮组大鼠子宫内膜组织Ang-1、Ang-2蛋白表达均显著降低(P<0.05)。见图1。

图1 Western blot检测大鼠子宫内膜异位症子宫内膜组织Ang-1和Ang-2蛋白表达A：Ang-1和Ang-2蛋白电泳图；B：Ang-1蛋白表达量；C：Ang-2蛋白表达量

2.4原儿茶酸对大鼠子宫内膜异位症组织中ERK/VEGF/MMP通路的影响:与空白组比较，模型组大鼠子宫内膜异位症组织中p-ERK1/2、VEGF 、MMP-2和MMP-9的蛋白表达均显著升高；与模型组相比，原儿茶酸低剂量组、原儿茶酸中剂量组、原儿茶酸高剂量组、孕三烯酮组大鼠子宫内膜异位症组织中p-ERK1/2、VEGF 、MMP-2和MMP-9的蛋白表达均显著降低(P<0.05)。与原儿茶酸低剂量组相比，原儿茶酸中剂量组、原儿茶酸高剂量组、孕三烯酮组大鼠子宫内膜异位症组织中p-ERK1/2、VEGF 、MMP-2和MMP-9的蛋白表达均显著降低(P<0.05)；与原儿茶酸中剂量组相比，原儿茶酸高剂量组、孕三烯酮组大鼠子宫内膜异位症组织中p-ERK1/2、VEGF 、MMP-2和MMP-9的蛋白表达均显著降低(P<0.05)。见图2。

图2 Western blot检测大鼠子宫内膜异位症组织中t-ERK1/2、p-ERK1/2、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达A：t-ERK1/2、p-ERK1/2、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白电泳图；B-F：t-ERK1/2、p-ERK1/2、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达量

3 讨 论

原儿茶酸对机体的多种疾病均具有炎症和氧化应激抑制的作用[9,10]，但是其在子宫内膜异位症中是否具有治疗功能尚未可知。张玉珠等[11]研究报道，原儿茶酸明显的减脂多糖对小鼠子宫内膜的病理损害，浓度依赖性抑制小鼠子宫内膜组织中致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌。遗憾的是，原儿茶酸在子宫内膜异位症中的治疗作用并未进行相关研究。为了填补这一空白，本研究成功建立了子宫内膜异位症大鼠模型，观察原儿茶酸对模型大鼠是否有治疗效果，结果显示：子宫内膜异位症大鼠在第14d、42d时病灶体积明显变大，TNF-α、IL-6、IL-1β分泌增多，异位子宫内膜组织血管生成因子Ang-1、Ang-2表达升高，这证明大鼠的子宫内膜异位症模型制造成功。深入研究，给予不同浓度的原儿茶酸治疗，发现模型大鼠的病灶明显减少了，致炎因子的分泌量也降低了，Ang-1、Ang-2的水平也下降了，并且这些作用与原儿茶酸具有浓度依赖性，这些实验结果揭示了原儿茶酸对子宫内膜异位症的治疗潜力。大鼠子宫内膜异位症涉及炎症、血管生成，其参与的分子有炎症相关的细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α及PCT、SAA、CRP等，血管生成相关的血管内皮生长因子可溶性受体-1(sFlt-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(Ang)，而本文中检验的指标TNF-α、IL-6、IL-1β代表炎症的变化，Ang-1、Ang-2指标表示血管生成的变化。

血管内皮生长因子(VEGF)是一种有效的血管生成诱导剂，被确定与肿瘤血管生成相关[12]。基质金属蛋白酶(MMPs)在蛋白水解、降解以及血管生成过程中降低细胞黏附，促进细胞迁移中发挥关键作用[13]。ERK是丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号级联的成员，参与磷酸化级联调节的多种生物学过程，如细胞的迁徙[14]。戴晓晓等[15]在子宫内膜异位症的研究中报道，ERK/VEGF/MMP9信号通路参与疾病的致病过程，并且该通路的活性可被熊果酸抑制，以发挥子宫内膜血管生成的抑制作用。本研究发现，在子宫内膜异位症模型大鼠的异位子宫没摸组织中p-ERK、VEGF 、MMP-2和MMP-9的蛋白表达均上调，说明了该通路的活性被异常激活，再次揭示了ERK/VEGF/MMP通路激活对子宫内膜异位症发挥致病作用。原儿茶酸给药治疗，呈现浓度依赖性降低p-ERK1/2、VEGF 、MMP-2和MMP-9的表达水平，抑制ERK/VEGF/MMP通路的活性，这说明原儿茶酸发挥子宫内膜异位症的治疗效果与失活ERK/VEGF/MMP通路存在一定的相关性。

综上所述，原儿茶酸缩小子宫内膜异位症大鼠的子宫内膜损伤面积，抑制炎症反应，产生这种作用的机制可能与抑制了ERK/VEGF/MMP通路活性有关，为原儿茶酸在临床上用于子宫内膜异位症的治疗奠定实验基础。