T细胞亚群中Ki-67的表达及与自闭症儿童肠道菌群结构、核心症状的关联及价值研究

杨锦容,苏雅丹,朱竞繁,巫清鹏

(1.惠州市中心人民医院 儿科,广东 惠州516000；2.惠州市第六人民医院 儿科,广东 惠州516211；3.惠州市第六人民医院 神经内科,广东 惠州516200；4.广东省河源市妇幼保健院 发育行为专科,广东 河源517300)

自闭症(ASD)为神经行为发育障碍，临床主要表现为社交障碍、兴趣狭窄、刻板行为[1]，可能与早期肠道菌群失调、免疫状态异常相关，自闭症发生后，患儿可出现胃肠胀气、腹泻、便秘等肠胃功能紊乱[2]。研究显示[3]，肠道菌群的改变可促进自闭症的发展，且自闭症可导致患儿免疫系统失调，T淋巴细胞发生改变。Ki-67高表达于增殖细胞，在多种癌症的诊断中具有重要意义[4]。基于此，本文分析T细胞亚群中Ki-67的表达及与自闭症儿童肠道菌群结构、核心症状的关联及价值研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2020年4月-2021年4月惠州市中心人民医院收治的50例自闭症儿童为研究对象，作为研究组，另外选取来院体检的50例典型发育儿童作为对照组，两组一般资料具有可比性(P>0.05)。本研究经伦理委员会批准。

纳入标准：患儿均符合《孤独症谱系障碍儿童早期识别筛查和早期干预专家共识》[5]中对于自闭症的诊断标准。

排除标准：存在严重躯体障碍，神经发育出现障碍，存在其他慢性、急性疾病，患儿存在脑损伤，患有感染性疾病。

1.2 方法

1.2.1Ki-67表达水平检测 采集两组儿童空腹静脉血5 ml，以离心半径15 cm，转速3 000 r/min离心处理10 min，提取上层清液，于-80℃保存，待检。使用抗CD3，抗CD4，抗CD8，抗CXCR4，抗CXCR7，抗CD45R，抗HLA-DR，抗Ki-67，抗GATA3，抗Helios和抗FOXP3抗体染色。固定细胞并通透，使用FC 500流式细胞仪Beckman Coulter使用CXP软件采集和分析数据。使用Trizol试剂从PBMC中提取RNA并根据试剂盒说明步骤进行定量。用Nandrop分光光度计测定RNA浓度。使用高容量cDNA逆转录试剂盒合成cDNA。使用SYBR Green预混液进行定量RT-PCR。测定中使用的引物如下：Ki-67，F：5-GGATCGTCCCAGTGGAAGAG-3′，R：5′-TCTCGTGGGCCACATTTTC-T-3′；GAPDH，F： 5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′，R： 5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。数据以Ki-67相对GAPDH的mRNA表达的变化表示。

1.2.2肠道菌群检测 采集所有儿童新鲜粪便，放于-80℃，保存，待检。提取粪便中DNA，采用MiSeq对其进行检测，后采用SiLva数据库对其肠道菌群多样性、肠道菌群门水平检测。

1.2.3ABC评分检测 采用孤独症行为量表(ABC)对患儿病情严重程度进行评价，该量表共5个维度，评分越高，患儿病情越严重。采用SRS量表评估患儿社交障碍情况，分数越高，症状越严重。采用CARS量表评估患儿孤独症状，分数越高，症状越严重。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 T细胞亚群中Ki-67的表达水平

如表1所示，与对照组相比，研究组患儿CD3+、CD4+、CD8+、CXCR4、CXCR7、CD45R、HLA-DR、GATA3细胞产生的Ki-67表达水平较高，Helios、FOXP3细胞产生的Ki-67表达水平较低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组肠道菌群结构比较

如表2所示，与对照组相比，研究组患儿Chao1指数、Ace指数、Shannon指数降低，Simpson指数升高，拟杆菌门、放线菌门水平降低，厚壁菌门、变形菌门水平升高，具有统计学差异(P<0.05)。

表1 对照组与研究组患儿T细胞表面受体细胞中Ki-67表达水平

表2 对照组与研究组患儿肠道菌群结构比较

2.3 各组核心症状比较

如表3所示，与对照组相比，研究组患儿ABC、SRS、CARS评分升高，具有统计学差异(P<0.05)。

表3 各组核心症状比较

2.4 Ki-67表达水平对自闭症儿童肠道菌群结构的影响结果

CD3+、CD4+、CD8+、CXCR4、CXCR7、CD45R、HLA-DR、GATA3细胞中Ki-67表达截断值为(0.947，0.910，0.955，1.234，0.915，1.880，1.740，0.915，0.545，0.615)，本研究中，5项及以上Ki-67表达异常，定为Ki-67异常组(n=32)，其余为Ki-67非异常组(n=18)。如表4所示，与Ki-67非异常组相比，调整其混杂因素，发现Chao1指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数、拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门为影响患儿Ki-67异常的危险因素，Ki-67异常组患儿Chao1指数、Ace指数、Shannon指数、拟杆菌门、放线菌门低于Ki-67非异常组，Simpson指数、厚壁菌门、变形菌门高于Ki-67非异常组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表4 Ki-67表达水平对自闭症儿童肠道菌群结构的影响结果

2.5 Ki-67表达水平对自闭症儿童核心症状的影响结果

如表5所示，与Ki-67非异常组相比，调整其混杂因素，发现ABC、SRS、CARS为影响患儿Ki-67异常的危险因素，Ki-67异常组患儿ABC、SRS、CARS评分高于Ki-67非异常组差异具有统计学意义(P<0.05)。

表5 Ki-67表达水平对自闭症儿童核心症状的影响结果

3 讨论

Ki-67在T细胞中表达较高，其表达水平可影响患者免疫功能，导致其发生免疫障碍[6]。趋化因子受体可促进神经疾病的发展，促进神经元细胞T细胞活化，CXCR4表达于内皮细胞，促进内皮细胞发挥功能，CXCR7表达于小胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞、大脑神经元，可促进中枢神经系统的发展[7-8]。研究显示[9-10]，孕妇体内CXCR4表达水平升高可使新生儿自闭症发生率升高。HLA-DR为甲状腺功能减退、类风湿关节炎、自身免疫性糖尿病易感标志物，可促进自闭症的发展[11]。GATA3表达水平升高可使5-羟色胺能加速神经元发育，导致自闭症的发生，GATA3还可调节多巴胺β羟化酶活性，表达于中枢神经系统，脑中区域[12-13]。本研究发现，自闭症儿童CXCR4、CXCR7、HLA-DR、GATA3细胞中Ki-67表达水平升高，表明CXCR4、CXCR7、HLA-DR、GATA3细胞中Ki-67表达水平升高与儿童免疫功能失调、患儿行为、核心症状的改变有关，以至于其沟通能力、行为能力出现障碍，导致自闭症的发生。本文研究显示，Helios细胞Ki-67在ASD受试者中表达显著减少，这可能与这些个体的免疫功能障碍有关。FOXP3在平衡过度活跃的免疫系统方面起着至关重要的作用，其缺乏可能与自身免疫性疾病和ASD有关[14]。

肠道菌群与机体之间存在动态平衡，其多样性降低，可引起炎性肠性病、精神分裂症、免疫力降低、以及抑郁症的发生[16-17]。本文研究发现，自闭症儿童中肠道菌群多样性降低，可使其肠道菌群失衡，变形菌门丰富度升高，可使机体内肠道菌群发生紊乱，并使肠道炎性反应增加，应激反应升高，导致自闭症的发生。