RPS14在结直肠癌组织中的表达及意义

岳斯琦，魏丽萍，何成彦

(吉林大学中日联谊医院 检验科，吉林 长春130033)

结直肠癌作为癌症相关死亡的第四大原因，也是全球第三大最常诊断的恶性肿瘤。在东欧和亚洲地区，结直肠癌的发病率和死亡率上升迅速，预计到2030年，全球结直肠癌患者将新增220万确诊病例以及110万的死亡病例[1]。在最近的研究报告中指出进行结直肠癌早期癌症筛查诊断能显著降低结直肠癌死亡率[2]，本实验初步通过二维色谱质谱联用技术及免疫印迹实验来分析RPS14蛋白在结直肠癌组织与癌旁组织的差异，为结直肠癌的筛查和诊断提供帮助。

1 材料与方法

1.1 一般资料

吉林大学中日联谊医院组织标本库中2018年到2020年术前未经治疗的结直肠癌患者组织，所有标本均经病理学诊断为腺癌，共计16例。在患者术中留取结直肠癌组织和距离癌组织边缘7 cm处的癌旁组织，完成采集迅速冷却后用PBS彻底冲洗，液氮速冻，储存在温度为-80℃的冰箱中待用。研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂

高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，LTQXL 离子阱质谱仪(美国赛默飞公司)，电泳仪(柏奥易杰北京科技有限公司)，RPS14单抗(美国Affinity公司)，β-actin多抗(美国abcam公司)。BCA蛋白质定量试剂盒(美国伯乐公司)，碘代乙酰胺，DNA酶，RNA酶，TPCK修饰的测序级胰酶(美国西格玛公司)。

1.3 方法

1.3.1蛋白提取及样品制备 取出储存于-80℃冰箱的样本将其在液氮条件下研磨至粉末状，在粉末中加入适量的蛋白裂解液并充分振荡混匀30 min。后续在样本中加入DNA酶和RNA酶来去除样本残留的物质，在4℃条件下1 200 rpm离心10 min。用BCA法测定蛋白的浓度后，用酶标仪测定样品OD562值绘制蛋白质浓度标准曲线，在加入一定比例的上样缓冲剂后，煮沸冷却至室温，在冰箱(-80℃)中储存备用。

1.3.2二维质谱色谱联用技术鉴定蛋白多肽 0.1%的FA与配制好的蛋白样品相溶解，经阳离子交换柱和反向柱洗脱分离蛋白样品后经LTQXL离子阱质谱仪分析检测，在通过全扫描和二级扫描后获取质谱数据。

1.3.3免疫印迹试验 SDS-PAGE电泳，按照说明书配置好10%APS水溶液放入4℃冰箱中保存，加入分离胶A和分离胶B后迅速加入APS及TEMED，混匀后注入到玻璃板内，插板后等待1 h左右，注意避免产生气泡。通过组织浓度和固定上样质量(60 μg)计算出每孔需要的上样体积，将配置好的电泳液倒入电泳槽内没过凝胶，保持胶体湿润，在每孔依次加入定量的Marker和Loading buffer，在80V条件下通电1.5 h。用稀释好的快速转膜液在400 mA的条件下转膜20 min，加入快速封闭液，孵育一抗过夜(4℃)，用PBS-T清洗NC膜3次后加入二抗低温孵育1 h，PBS-T再次洗膜5次后用ECL荧光化学法发光显色，将显影液与定影液按照1∶9的比例配好，各自浸没5 min。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 二维色谱与质谱联用技术分析结果

本实验癌组织及癌旁组织中同一蛋白的丰度通过图谱数来衡量，差异蛋白的满足条件为两个样品中蛋白图谱数比值 ≥1且蛋白图谱数差值 ≥72。在此标准下共检测到ARGAL、CUL48、B3KXD6、E5RH53、CDK5、B4E0Y9、RPS14和60 kD线粒体热休克蛋白共8个上调蛋白，ACTS、DESM、ACTN1、A1AT、TLN1、KCRB、CNN1、MYH14、纽蛋白亚型2、热休克蛋白β1共10个下调蛋白。RPS14作为其中一个上调蛋白，质谱图结果见图1。

2.2 免疫印迹试验结果

运用WB方法，分析16对组织的RPS14表达量检测发现RPS14在结直肠癌组织中高表达，如图2所示。

图1 RPS14 质谱图结果

图2 RPS14 免疫印迹结果

3 讨论

结直肠癌作为世界范围内最常见和致死率较高的癌症之一，在2021年的流行病学报告中显示，全世界范围内早发性结直肠癌患者的发病率和死亡率不断增加，防范重心倾向于在50岁以下的人群中积极展开CRC的筛查和随访[3]。结直肠镜检是CRC筛查的金标准，但镜检存在检测费昂贵、技术要求高、并发症多、适用性差等局限性。近年来先进的分子技术在结直肠癌检测和治疗方面发展迅速，尤其是血液中的生物标志物如蛋白质、肿瘤DNA、肿瘤细胞和血液中的RNA等都常用于结直肠癌的诊断，其灵敏度和特异度都高于FOBT和FIT，逐渐成为癌症检测的新风向[4]。

RPS14被称为核糖体蛋白小亚基14，又名S14、uS11，是核糖体蛋白家族的重要成员，该家族在原核和真核细胞中普遍表达。在结构上，RPS14由五个外显子和四个内含子组成多个功能不同的多态结构域，其中结构域B和D是RPS14生物活性所必需的部分[5-6]。在功能上，RPS14过表达将诱发细胞周期停滞和衰老[7]并调节P53通路的激活而影响肿瘤细胞的增殖[8]。此外，RPS14与肺鳞状细胞癌[9]、膀胱癌[10]、肝细胞癌[11]及其亚型酒精性肝细胞癌[12]的发生发展密切相关，RPS14于2017年在乳腺癌的生信分析中首次被筛选出来[13]，低表达RPS14细胞株抑制了乳腺癌的增殖、迁移并显著诱导细胞凋亡[14]。RPS14于2022年也通过生信分析手段推测其可能是通过调节核糖体途径而影响结直肠癌发生发展的关键基因[15]。近年来，随着LC-MS技术的发展，其在蛋白质的定性和定量方面都有广泛的研究，又因LC-MS具有选择性高、灵活性大和稳定性强的特点，常常被认为是替代传统方法分析蛋白质的最佳选择[16]。因此本研究选择通过二维质谱色谱联用技术(LC-MS)发现在结直肠癌组织上高表达的RPS14基因并通过免疫印迹实验的方法对处于Ducks’B期的结直肠癌及癌旁组织进行了分析和验证，实验结果证明RPS14在结直肠癌组织中高表达，并与癌旁组织有显著差异。因此推测RPS14高表达与结直肠癌的发生发展有一定联系，如果在未来能对RPS14进行更多的细胞功能实验和机制的研究，RPS14将在结直肠癌诊断方面有更显著的贡献。