滋肾泻青汤对ADHD模型大鼠前额叶多巴胺受体脱敏-复敏信号通路的影响

孙继超,张碧霞,李伟伟

(广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023)

注意缺陷多动障碍(Attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)是儿童常见的神经发育障碍性疾病,其核心症状表现为与年龄不相称的注意力不集中、多动和冲动行为,全球患病率为6%～8%[1]。目前ADHD发病机制尚不明确,研究认为该病是由遗传与环境共同作用导致的,其中针对分子遗传学的相关研究,尤其是有关“多巴胺系统缺陷”假说是研究的热点[2]。

滋肾泻青汤是遵从钱乙“五脏辨证”理论中“补虚泻实”的原则组方,由熟地黄、山萸肉、白芍、丹皮、何首乌、杜仲、龙胆草、柴胡、石菖蒲、甘草组成,具有益肾填精、疏肝泻火、安神定志的功效,适用于ADHD证属肝肾阴虚的患儿。方中熟地黄填精益髓，滋阴补肾,为本方之君药。山萸肉滋补肝肾，补血固精,何首乌补益精血,杜仲补肝肾,柴胡为“肝胆之要药”,味苦微寒,疏肝解郁,共为臣药。白芍柔肝敛阴，平抑肝阳,丹皮清泻虚热兼缓山萸肉温涩之药性,龙胆草泻肝胆之火,石菖蒲开窍豁痰，醒神益智共为佐药,甘草调和诸药为使。诸药配伍,补中有泻,泻中寓补,补泻兼施,补大于泻,可补肝肾之阴,兼顾清泻“风”“火”“痰”等病理产物[3]。

临床研究表明滋肾泻青汤治疗ADHD有较好的疗效[3],为进一步阐明滋肾泻青汤方治疗ADHD的作用机制,本实验拟基于模型动物前额叶的多巴胺受体脱敏-复敏信号通路进行相关研究,以期为后期该方的进一步推广提供参考。

1 材料

1.1 动物

3周龄SPF级雄性WKY大鼠10只,SHR大鼠50只,体质量(62～75)g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2016-0011。大鼠饲养于广西中医药大学动物实验中心,自由饮食进水,正式实验前适应性饲养5 d。实验经过广西中医药大学伦理委员会审核，伦理编号：20180310。

1.2 药物

滋肾泻青汤方由熟地黄15 g，山萸肉10 g，白芍15 g，丹皮10 g，何首乌10 g，杜仲10 g，龙胆草5 g，柴胡10 g，石菖蒲10 g，甘草6 g组成,药材同批次购自广西中医药大学第一附属医院。将药液浓缩至0.41、0.80、1.61 g·mL-1,4 ℃保存备用。

利他林片(10 mg·片-1,批号:210619,苏州第一制药有限公司)。加双蒸水溶解成0.067 g·L-1的混合液,4 ℃保存备用。

1.3 主要仪器

pH酸度仪、精密天平(德国Sartorius公司);ChemiDoc MP凝胶成像系统、Trans-Blot SD半干转印仪、电泳槽(美国Bio Rad公司);M200 pro酶标仪(瑞士Tecan公司);Light Cycle型DNA荧光定量分析仪(德国Roche公司);Quantsdudio7荧光PCR仪(美国Life公司)等。开场试验、水迷宫等行为学设备购自北京硕林苑科技有限公司,设备规格:开场实验箱(100 cm×100 cm×40 cm),温控水迷宫池(150 cm×50 cm),设备均经黑色喷漆处理。通用小动物轨迹分析系统(SLY-ETS Version 1.66)。

1.4 主要试剂

β-actin多克隆抗体(美国Santa cruz，批号:sc-47778);Anti-GRK-6抗体、Anti-β-arrestin2抗体、Anti-NCS-1抗体、Anti-PSD-95抗体、Anti-PP2A抗体(美国Abcam公司,批号：ab106673、ab167047、ab129166、ab18258、ab32141)；羊抗兔二抗(美国Abcam,批号：ab6271);BCA试剂盒、ECL化学发光底物(美国Thermo,货号：23227、32109);逆转录试剂盒、Trizol、RT-PCR试剂盒(日本TAKARA,货号：9109、RR036A、RR820A)；PCR吸头和离心管均为一次性无RNA酶产品,氯仿等其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 动物分组及处理

将10只WKY大鼠设为正常对照组,按数字表法将50只SHR大鼠随机分为5组:模型组，利他林组，滋肾泻青汤低、中、高剂量组,每组10只。服药量根据9岁(体质量26 kg)儿童体表面积和4周龄(体质量60 g)SHR幼鼠体表面积进行换算[4]。正常对照组、模型组均以双蒸水0.015 mL·g-1灌胃,滋肾泻青汤低、中、高剂量组分别以对应中药溶液0.015 mL·g-1灌胃,合生药量利他林组2 mg·kg-1，滋肾泻青汤低剂量组、中剂量组、高剂量组6.0、12.1、24.1 g·kg-1,每日2次,持续4周。

2.2 行为学检测

当天首次给药1 h后开始,在第2次灌胃前结束行为学测试,检测过程中保持外界环境一致。实验方法参照课题组前期实验方法[5]。

开场实验:分别在给药前及给药后2、4 周进行。将大鼠置于开场实验箱中央区域,系统自动记录大鼠5 min内的总运动距离(m),摄像头跟踪描绘动物运动轨迹。

Morris水迷宫:在治疗3周时进行。实验连续进行6 d,第1～5天进行隐蔽站台实验,第6天进行空间探索实验。统计各组大鼠第1～5天的潜伏期时间及第6天潜伏期的数据。

2.3 样本处理

末次给药后次日处死大鼠,冰台上分离大脑前额叶组织,保存在液氮中,后转移至超低温冰箱备用。

2.4 Western blot法

蛋白提取、制胶及计算方法同前[6]。一抗浓度分别为:兔源GRK-6一抗(1∶1 000)、兔源β-arrestin2一抗(1∶1 000)、兔源NCS-1一抗(1∶2 000)、兔源PSD-95一抗(1∶500)、兔源PP2A一抗(1∶5 000)。

2.5 引物设计

根据Gen-Bank设计引物,由生工生物工程有限公司完成,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,序列参见表1。

表1 引物序列

2.6 实时定量PCR法

脑组织提取RNA步骤及计算方法同前[6]。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 滋肾泻青汤对SHR大鼠开场实验运动距离的影响

结果如表2所示,与正常组相比,SHR大鼠在开场实验中的活动距离显著增加(P<0.01);经药物干预后,与模型组对比,利他林组及中药干预组的活动距离有所减少,其中滋肾泻青汤各剂量组均可减少SHR大鼠的开场实验运动距离(P<0.05，P<0.01)。

表2 滋肾泻青汤对SHR大鼠开场实验活动距离的影响

3.2 滋肾泻青汤对SHR大鼠水迷宫隐蔽站台实验潜伏期的影响

结果如表3所示,与正常组相比,SHR大鼠在水迷宫隐蔽站台实验潜伏期的时间明显减少(P<0.01);经药物干预后,与模型组对比,利他林组及中药干预组大鼠在水迷宫隐蔽站台实验潜伏期的时间有减少趋势或显著减少(P<0.05，P<0.01)。

表3 滋肾泻青汤对SHR大鼠水迷宫隐蔽站台实验潜伏期的影响

3.3 滋肾泻青汤方对大鼠前额叶多巴胺受体脱敏-复敏信号通路相关蛋白表达的影响

与正常组相比,模型组PP2A蛋白有下降趋势,无统计学差异,β-arrestin2、NCS-1、PSD-95蛋白表达明显降低(P<0.05),而GRK-6的蛋白表达明显增加(P<0.05);治疗后,相比模型组,利他林组和滋肾泻青汤治疗组有上调β-arrestin2、NCS-1、PSD-95、PP2A蛋白表达的趋势或能显著提高上述蛋白的表达(P<0.05),同时有下调GRK-6蛋白表达的趋势或显著下调GRK-6的蛋白表达(P<0.05)。见图1。

注: WKY+DDW.正常对照组;SHR+DDW.模型组;SHR+MPH. 利他林组;SHR+ZXT-L、M、H.滋肾泻青汤低、中、高剂量组。与WKY+DDW组比较,*P<0.05;与SHR+DDW组比较,

3.4 滋肾泻青汤方对大鼠前额叶多巴胺受体脱敏-复敏信号通路相关因子mRNA表达的影响

与正常组相比,模型组PP2A的mRNA表达有下调趋势,β-arrestin2、NCS-1、PSD-95 mRNA表达明显降低(P<0.05),GRK-6的mRNA表达明显增加(P<0.05);治疗后,与模型组相比,利他林组和滋肾泻青汤治疗组有上调β-arrestin2、PSD-95、NCS-1、PP2A mRNA的表达趋势或能显著提高上述mRNA的表达(P<0.05),有下调GRK-6的mRNA表达的趋势或能显著下调其表达(P<0.05),且以利他林组和滋肾泻青汤高剂量组疗效为佳,见图2。

注:WKY+DDW.正常对照组;SHR+DDW.模型组; SHR+MPH.利他林组;SHR+ZXT-L、M、H.滋肾泻青汤低、中、高剂量组。 与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,

4 讨论

ADHD患儿在学龄期往往存在学习困难、人际关系不佳等问题,若不经正规持续合理的治疗,症状可能会持续终身,导致成年后职业成就低,社会功能受到损害。循证医学结果表明,经过正确诊断及合理治疗,该病往往可以取得较好的治疗效果,从而改善学业、工作、社会功能等诸多问题。尽管目前ADHD的发病机制不明,但多巴胺系统功能的缺陷,特别是其对前额叶-纹状体环路的调控异常,被认为与ADHD的发病密切相关[7-9]。而前额叶皮质的神经功能与ADHD症状表现密切相关,包括注意力集中、工作记忆和执行功能等,故本实验将前额叶皮质作为研究部位,探讨复方滋肾泻青汤治疗ADHD的潜在作用机制。

本实验重点研究滋肾泻青汤对SHR大鼠行为学及前额叶皮质多巴胺受体脱敏-复敏信号通路的影响。脱敏即受体对激动剂刺激做出不反应或反应减低,包括同源性脱敏及异源性脱敏。同源性脱敏指激动剂引起的G蛋白偶联受体与其相应G蛋白的解偶联,因此使G蛋白偶联受体失活,其过程与G蛋白偶联受体激酶(GPCR kinase, GRK)、β-arrestins磷酸化受体密切相关[10-12];异源性脱敏指与该受体激动剂无关的脱敏,即该受体并未受到其选择性激动剂刺激的情况下出现脱敏,其与细胞第二信使系统激酶的激活关系密切,如多巴胺D1受体是蛋白激酶A(Protein kinase A, PKA)的磷酸化位点[13-14];有研究表明神经元钙感应蛋白(Neuronal calcium sensor-1,NCS-1)与D2受体脱敏机制存在关联[15]。复敏指的是受体内吞后被细胞内的磷酸酶去磷酸化,并被重新回收到膜上继续行使其功能的过程,这一过程与细胞内的磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)的功能相关[16];除了上述机制,新的研究表明突触后致密物-95(Postsynaptic density-95,PSD-95)可提高多巴胺受体的复敏[17-18],说明多巴胺受体的表达受到脱敏、复敏双向机制的调控。综上,上述信号通路任何环节的异常均可通过脱敏-复敏的状态影响多巴胺受体的功能。

实验结果提示利他林及滋肾泻青汤能改善大鼠行为学的表现,减少其多动表现;并能影响SHR大鼠前额叶皮质中多巴胺受体脱敏-复敏信号通路中相关调控因子的表达。与正常组相比,模型组中β-arrestin2、NCS-1、PSD-95和PP2A的蛋白及mRNA相关表达呈下调趋势,而GRK-6的相关表达则被上调。说明较正常组,模型组多巴胺受体影响复敏的相关因子表达减弱,而影响脱敏的相关因子有增强表达,提示脱敏发挥的效应可能强于复敏,从而影响了多巴胺受体的功能。经药物干预后,药物组能上调大鼠前额叶皮质中β-arrestin2、NCS-1、PSD-95和PP2A相关表达的同时能下调GRK-6的表达,提示药物有增强受体复敏、减少脱敏的干预作用。综合分析实验结果后,推测滋肾泻青汤作用机制可能与抑制多巴胺受体脱敏、促进复敏有关,进而影响多巴胺受体的功能,达到改善行为学表现的目的。