基于“肠-肾轴”理论探讨益肾化湿颗粒改善糖尿病肾病的临床疗效及作用机制

艾珊珊,崔涛,周乐,申振,李伟,韩聪

(1.济宁医学院中西医结合学院,山东 济宁 272067;2.济南市章丘区中医医院肾病科,山东 济南 250200;3.山东中医药大学附属医院,山东 济南 250014;4.山东中医药大学第一临床医学院 山东 济南 250014)

糖尿病肾病(DKD)是由糖尿病(DM)引起的肾脏损伤,主要表现为蛋白尿、肾小球滤过率(eGFR)持续下降及微血管病变等[1]。临床多采用降糖、降压、饮食控制等常规治疗,可适当延缓疾病进展,但仍有部分患者疗效不甚明显,因此积极寻求有效的防治策略,具有重要的临床和社会意义。益肾化湿颗粒是一种广泛应用于治疗慢性肾小球肾炎的中成药,具有升阳补脾、益肾化湿、利水消肿的功效,多项临床研究表明益肾化湿颗粒可改善DKD患者的症状,抑制炎症反应,稳定肾功能[2-5]。近年来关于“肠-肾轴”的研究揭示了肠道菌群可通过影响糖脂代谢、内毒素积累、炎症反应、氧化应激等调节肾脏代谢进而影响DKD进程[6]。本团队的前期实验研究结果表明益肾化湿颗粒能通过“肠-肾轴”调节肠道菌群结构,降低肠道通透性,增加乳杆菌属等益生菌含量,降低厌氧螺菌属等条件致病菌含量,改善DKD大鼠糖脂代谢,减轻炎症水平,保护肾功能[7]。基于此,本研究拟通过研究益肾化湿颗粒治疗DKD的临床疗效及肠道菌群的变化,探讨其通过“肠-肾轴”改善DKD的作用机制。

1 临床资料

1.1 样本量计算

使用临床试验的样本量计算公式:n=(uα+uβ)22p(1-p)/(p1-p0)2,查阅相关文献报道[3-5],p0代表西医对症治疗后的达到疗效约为60%,p1代表西医对症治疗加用益肾化湿颗粒后达到的疗效约为88%,计算出n≈42,即每组的样本量为42,考虑到15%的脱失率,拟每组的样本含量为42/(1-15%)≈50例。

1.2 一般资料

选取2020年11月至2021年8月于山东中医药大学附属医院肾病科就诊的DKD脾虚湿盛证患者100例,按随机数字表法分为试验组及对照组,对结局评估者进行设盲。试验组男31例,女19例;平均年龄(60.52±10.04)岁;平均收缩压(127.26±8.23)mmHg;平均舒张压(81.68±8.69)mmHg。对照组男27例,女23例;平均年龄(59.14±10.89)岁;平均收缩压(128.82±7.89)mmHg;平均舒张压(81.48±9.94)mmHg。2组患者一般资料、慢性肾脏病分期及尿蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经山东中医药大学附属医院医学伦理委员会批准(伦理批号:KY2020-046)。

1.3 诊断标准

1.3.1 西医诊断标准 符合《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》[8]与《CKD评估与管理临床实践指南,KDIGO,2012》[9]制定的DKD诊断标准:有确诊的糖尿病病史,根据尿蛋白肌酐比值(UACR)增高或肾小球滤过率(eGFR)下降、同时排除其他慢性肾脏病(CKD)。本研究选取患者分期为G1A1-G3aA3,参照2009年CKD流行病学协作组提出的CKD-EPI公式[10],G1-G3a即eGFR>45 mL·min·1·1.73 m-2,A1期:ACR<30 mg·g-1,A2期:ACR 30～300 mg·g-1,A3期:ACR>300 mg·g-1。

1.3.2 中医诊断标准 参考《中药新药临床研究指导原则》[11]中脾虚湿盛证诊断标准,主症:颜面部或肢体浮肿,疲倦乏力,食少纳呆,便溏;次症:畏寒肢冷,腰脊酸痛;舌脉:舌淡胖嫩,舌苔白或白腻,脉沉细。具备主症2项加次症2项,结合舌脉即可诊断。

1.4 纳入及排除标准

1.4.1 纳入标准 ①年龄18～75岁;②符合CKD(G1A1-G3aA3期)及中医脾虚湿盛证诊断标准;③患者同意并签署知情同意书。

1.4.2 排除标准 ①其他继发性肾脏疾病;②合并有严重的心脑血管等原发性疾病或影响生存的其他严重疾病;③妊娠或哺乳期妇女;④近1月接受抗生素或微生物治疗;⑤正参与其他药物临床研究。

1.4.3 剔除及脱落标准 ①出现过敏反应或严重不良事件;②依从性差,未按要求服药;③纳入后资料不完全;④主动退出研究。

2 方法

2.1 治疗方法

对照组:予医学营养治疗、生活方式干预等一般治疗。常规给与盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司,每片0.5 g)口服,每次0.25 g,每日3次;达格列净片(阿斯利康制药有限公司,每片5 mg)口服,每次5 mg,每日1次;缬沙坦胶囊(天大药业有限公司,每粒80 mg)口服,每次80 mg,每日1次。

试验组:在对照组治疗基础上加用益肾化湿颗粒(广州康臣药业,每袋10 g),热水冲服,每次10 g,每日3次。若血压控制不佳可加用非ACEI/ARB类药物,原有方案不再加量。

2组患者均连续治疗8周。

2.2 观察指标及方法

2.2.1 实验室指标 采集患者治疗前后空腹静脉血各5 mL,肝素抗凝,3 000 r·min-1离心5 min后取血清,置-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法检测患者尿蛋白肌酐比值(UACR)、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1C)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、肾小球滤过率(eGFR)、白蛋白(ALB)、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素-6(IL-6)、尿N-乙酰-β氨基葡萄糖苷酶(NAG)水平或活性。以上委托山东中医药大学附属医院检验科完成。

2.2.2 中医证候积分评估 参照《中药新药临床研究指导原则》[11],记录治疗前后2组患者的中医证候积分,主症:颜面部或肢体浮肿,疲倦乏力,食少纳呆,便溏,按轻、中、重分别记为2、4、6分;次症:畏寒肢冷,腰脊酸痛按轻、中、重分别记为1、2、3分。积分越高,症状越严重。

2.2.3 临床疗效判定 参照《中药新药临床研究指导原则》[11]拟定。显效:①中医证候积分减少≥60%;②UACR值减少≥40%;③FBG 控制在7.0 mmol·L-1以下;④SCr、BUN等指标值均减少≥10%。有效:①中医证候积分减少≥30%;②UACR值减少,但没有达到显效标准;③FBG下降但未控制在7.0 mmol·L-1以下;④SCr、BUN等指标减少未达显效标准。无效:患者各项临床症状均无改善或者恶化,UACR等指标未下降甚至升高者。其中,①②③项为必备条件。

2.2.4 患者粪便16S rDNA V3+V4 区测序 治疗8周后无菌随机收集2组各30例患者粪便5 g至EP管,存于-80 ℃冰箱保存。提取患者粪便基因组 DNA,对16S V3+V4区进行PCR扩增,使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建库试剂盒构建文库,经Qubit和Q-PCR定量检测合格后使用NovaSeq6000进行上机测序。

2.2.5 安全性指标 治疗前后检测患者血常规、大便常规、肝功能,监测心电图,观察研究期间不良反应的发生情况。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 2组患者治疗前后中医证候积分情况比较

结果见表1。

3.2 2组患者治疗前后各生化指标情况比较

结果见表2、表3。

3.3 2组患者临床疗效比较

结果见表4。

表1 2组患者治疗前后中医证候积分比较

表2 2组患者治疗前后生化指标情况比较[M(P25,P75), n=50]

表3 2组患者治疗前后生化指标比较

表4 2组患者临床疗效比较(n=50)

3.4 2组患者安全性检测

2组患者均无不良反应出现,治疗前后未出现血常规、大便常规、肝功能等指标的异常。

3.5 2组治疗后肠道菌群 16S V3+V4测序

3.5.1 测序质量评估及物种注释分析 当测序序列接近 40 000时几乎无新的OTUs产生,表明测序深度足够,物种累积箱型图渐进平缓,提示样本量足够。见图1。

注:A.样品稀释曲线;B.物种累积箱型图;N.对照组;Y.试验组

3.5.2 肠道菌群多样性分析 通过Shannon、Simpson指数分析2组样本菌群群落,Alpha多样性结果显示试验组患者肠道菌群较对照组显著升高(P<0.05)。进一步对2组样本进行Beta多样性PCoA分析,结果试验组菌群样本聚合度明显优于对照组,提示组内患者间菌群构成差异较小。门水平条形图显示2组优势菌门均为拟杆菌门(Bacteroidota)和厚壁菌门(Firmicutes),且试验组F/B的值显著低于对照组(P<0.05)。见图2。

注:A.Shannon指数组间差异条形图;B.Simpson指数组间差异条形图;C.组间PCoA比较图; D.2组前10菌门条形图;E.F/B值组间差异条形图;N.对照组;Y.试验组;与对照组比较,*P<0.05。

3.5.3 组间差异属种筛选 通过统计丰度前10的菌属发现拟杆菌属(Bacteroides)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、副拟杆菌属(Parabacteroides)占主要地位；统计丰度排名前10的菌种发现普氏粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、普通拟杆菌(Bacteroidesvulgatus)、大肠埃希菌(Escherichiacoli)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、黏膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)占主要地位。在此基础上利用LEfSe分析组间丰度差异显著的物种，发现试验组的优势属种为副拟杆菌属、长双歧杆菌、黏膜乳杆菌，对照组优势属种为拟杆菌属、粪拟杆菌(Bacteroides-caccae)。见图3。

注:A.属水平物种相对丰度柱状图;B.种水平物种相对丰度柱状图;C.LEfSe差异物种;N.对照组;Y.试验组

4 讨论

近年来DM患病率急剧增加,DKD的患病率亦迅速增长,因其低知晓率和高死亡率,现已成为CKD和终末期肾病(ESRD)的主要原因[12]。祖国传统医学认为DKD属于中医学“肾消”“水肿”“虚劳”等范畴[13]。其由消渴病迁延而成,根本病机在于气阴不足，燥热内生。内热灼阴,致使肾阴不足;内热伤脾,脾气不足失于运化。脾肾既亏,固摄失常,则见水液停聚,精微下注,发为本病。李东垣指出“地气者,人之脾胃也,脾主五脏之气,肾主五脏之精,皆上奉于天,二者俱主生化以奉升浮,是知春生夏长，皆从胃中出也”[14],重在调理脾肾二脏。益肾化湿颗粒方中重用黄芪为君药，臣以人参、白术健脾益肾补气，气行则中焦通达，气旺则升发有力；佐以羌活、独活、柴胡、防风等诸风药，味薄气轻而升散之力强，功可升举阳气，气升湿化，祛风除湿，可免滋补而恋邪之忧患；白芍养血和营敛阴，又可防诸风药辛燥太过耗气伤阴；黄连、半夏、陈皮清热燥湿；茯苓、泽泻利水渗湿，导湿热从小便排出，浊邪去，而清阳得升；炙甘草为使药，调和诸药。整方补泻有度，升降相宜，共奏健脾益肾、升阳化湿之效，为脾虚湿盛证之效方。本研究显示,试验组可明显改善患者浮肿,疲倦乏力,食少纳呆，便溏，畏寒肢冷等临床症状,且有效率为84%,明显优于对照组。

研究表明[3, 15]IL-6的释放增加,可以促进炎性巨噬细胞的浸润,导致肾小球基底膜增厚,加速肾小球的硬化,从而加快肾小球的损伤。SOD可以催化超氧化物自由基转化为过氧化氢,其活性可反映机体抗氧化能力,通过减少自由基堆积、破坏足细胞,减少细胞外基质降解等保护肾脏。本研究显示益肾化湿颗粒可有效降低DKD患者UACR、HbA1C、IL-6水平,提高SOD活性和ALB水平,提示益肾化湿颗粒能一定程度降低DKD患者肠道通透性,减少毒素物质进入循环,降低尿蛋白水平,改善糖代谢,减轻炎症和氧化应激损伤，从而多靶点保护肾功能,延缓疾病进展。

Meijers、Ritz等团队相继提出的“肠-肾轴”“肠肾综合征”[16-17],认为肠道菌群失衡与肾脏疾病相互影响。研究表明[18],肠道菌群失调可增加肠道通透性、黏膜免疫反应,促进肠内代谢废物和致病菌种进入血液循环,产生大量炎症介质,减少短链脂肪酸含量,加重氧化应激损伤,增加胰岛素抵抗,促进DM进展。进一步扰乱RAS系统、损伤肾单位,降低肾小球滤过率,恶化肾功能[19-20]。肾损害导致的循环代谢废物过度蓄积通过受损肠壁进入肠腔,进一步加重肠内菌群紊乱,形成肠-肾恶性循环[21]。江毅等[22]发现气虚证患者肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门的比值较健康人群升高,肠道结构发生改变,表明肠道菌群的差异性改变可能是导致气虚证发生发展的生物学基础。内湿致病会使体内的肠道菌群稳态遭到破坏,出现肠道菌群失调,同时肠道菌群失调也是内湿致病的一个重要病理因素[23]。王卓等[24]发现脾虚湿盛证大鼠肠道较造模前菌群的数量及有益菌的种类明显减少,中药对症治疗后菌群逐渐恢复、中医症状减轻。故针对DKD脾虚湿盛证,肠道菌群的分布及丰度亦是重要的作用环节。

本研究通过高通量16S rDNA基因测序分析肠道微生物群,发现2组患者肠道微生物存在一定的差异性。试验组患者Shannon、Simpson指数高于对照组,F/B的值远低于对照组。Shannon指数、Simpson指数与肠道菌群群落多样性成正比,F/B的值与肠道菌群紊乱程度成正比。本研究结果显示益肾化湿颗粒在一定程度上纠正了DKD患者肠道菌群紊乱,稳定了菌群结构。进一步通过LEfSe分析发现试验组的优势属种为副拟杆菌属、长双歧杆菌和黏膜乳杆菌。有研究表明副拟杆菌属下的菌种狄氏副拟杆菌可以通过产琥珀酸和次级胆汁酸,降低糖代谢紊乱程度[25];长双歧杆菌可以降低血糖,缓解胰岛素抵抗,调节免疫,改善炎症状态[26-27];黏膜乳杆菌可以改善糖脂代谢,稳定屏障功能,减少“肠漏” 及病原体在肠道的定植,降低疾病易感性,后二者都可代谢产生乳酸、乙酸及醋酸盐,降低肠道pH值,阻止病原体生长,与其他共生微生物群(例如粪杆菌)构建微生物生态网络,共同改善肾脏代谢[28-30]。

综上,益肾化湿颗粒可有效改善DKD脾虚湿盛证患者的中医临床证候,降低患者血糖、蛋白尿、炎症及氧化应激损伤水平,并可以引起肠道菌群分布及丰度的改变,主要是副拟杆菌属、长双歧杆菌及黏膜乳杆菌等益生菌的含量升高。我们接下来将进行更为深入的粪菌移植研究。