腹主动脉瘤特异性ceRNA调控网络的筛选与构建

霍金龙，吴浪，赵纪春，郭又铭，瞿锐，赵礼金

（1.遵义医科大学附属医院 普通外科，贵州 遵义 563000；遵义市第一人民医院/遵义医科大学第三附属医院 2.乳甲中心 3.心脏血管外科，贵州 遵义 563000；4.四川大学华西医院 血管外科，四川 成都 610043）

腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）一般指肾动脉下方的腹主动脉呈瘤样扩张，通常直径增大50%以上或直径≥3 cm，是一种常见的、具有潜在致命性的血管退行性疾病，其特征是腹主动脉（abdominal aorta，AA）壁变弱，随后逐渐扩张，最终导致扩张的动脉破裂[1]。在老年男性（＞65 岁）和女性（＞60 岁）发病率分别约为8%、1.53%[2]，若发生破裂则致死率可达80%～90%[3-4]。AAA 形成的典型病理特征较为复杂，包括血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）表型转换、VSMC 凋亡、炎症细胞浸润、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑、强烈的氧化应激、内皮细胞（endothelial cells，EC）功能障碍、腔内血栓形成、主动脉壁的恶化等[5]。目前具体发病机制不明，因此，阐明AAA 发病机制对疾病诊断、预测进展、治疗和预后具有重要的意义。

2011 年Salmena 等[6]在《Cell》上首次提出内源性竞争RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）调控网络概念，这是转录组中各RNA 相互间的新的调控模式，其认为各RNA 共同构成了一种复杂的网络体系并处于动态平衡，网络中某一分子的表达上调或下调就会影响一系列的变化，最终这种动态平衡被破坏，从而导致机体出现相应异常表现。在ceRNA 调控网络中，微小RNA（miRNA）处于其核心地位，它是一种长度约为20 个核苷酸的非编码小RNA，通过碱基互补原则与靶基因结合来调控靶基因的表达[7]。调控网络中，能与miRNA 竞争性结合调控靶基因表达水平的RNA 称为ceRNA，常见的有长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circular RNA）。lncRNA 是长度＞200 个核苷酸的非编码RNA[8]，具有表观、转录和转录后水平调控基因表达的潜力，并在生理过程中发挥重要作用[9]。lncRNA 的表达和调控在某些组织、细胞和疾病具有高度特异性，这使它们有希望成为新的治疗干预点和生物候选标志物[10-11]。研究表明lncRNA 参与了多种疾病的ceRNA 网络构建，其作为上游分子竞争性与miRNA 结合，从而影响下游靶基因（即mRNA）的表达水平[12-14]，这 种lncRNA-miRNA-mRNA 网络对疾病的发生发展起到关键的调控作用。因此，构建ceRNA 网络为探索疾病中尚未被鉴定的相关lncRNA 的功能提供了一个新的视角。

本研究结合基因表达数据库（GEO 数据库），选择人的AAA 和AA 组织的转录组数据，筛选出AAA 和AA 的差异lncRNA（DElncRNA）和差异mRNA（DEmRNA），进一步构建了AAA 特异性基因诊断模型，通过预测与lncRNA 和mRNA 结合的miRNA，构建了特异性基因诊断模型分子所参与的ceRNA 网络。这不仅进一步认识AAA 的发病机制，而且为AAA 的诊断提供了新的分子标记物及潜在的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 GEO数据集筛选及数据处理

从GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中检索关键词“Abdominal Aortic Aneurysm”，阅读数据集题目及摘要，选择合适的数据集进行后期分析。若有多个数据集则将合并数据去批次校正减少合并后数据误差。

1.2 差异基因分析

基于生物信息学，利用R 语言对训练集中提取的基因进行注释，log fold chang（|logFC|）＞1 或＜-1，矫正后的P＜0.05 作为标准筛选DEmRNA；以矫正后的P＜0.05 作为标准筛选DElncRNA，并绘制差异基因的火山图及热图，基因富集分析（GO 和KEGG）展示AAA 差异基因在细胞功能及信号通路上的区别。

1.3 AAA基因诊断模型构建

利用Lasso 回归对筛选的差异基因进行进一步优化分析，寻找诊断AAA 的最具有特征性的差异基因。

1.4 基因诊断模型中ceRNA网络构建

首先通过Starbase 数据库预测与之结合的miRNA；通过DElncRNA 预测与之结合的miRNA，两者取交集，利用cytoscape 软件构建lncRNAmiRNA-mRNA 的ceRNA 网络。利用cytoscape 中的cytoHubba 模块寻找参与AAA 发展的关键ceRNA网络。

2 结果

2.1 筛选后的数据集

在GEO 数据库检索后共得到819 个AAA 相关数据集，最终经筛选后获得两个数据集：GSE7084、GSE57691，将GSE7084 及GSE57691 两数据集数据合并，共计AA 组18 例，AAA 组56 例。

2.2 差异基因分析

合并后的数据按|logFC|＞1，矫正后的P＜0.05，共筛选DEmRNA 114 个（上调基因34 个，下调基因80 个）（图1）；基因GO 富集分析显示，差异生物学功能主要体现肌肉系统过程（muscle system process）、抗氧化反应（response to oxidative stress）、肌肉收缩（muscle contraction）等差别上；基因KEGG 富集分析显示差异基因主要体现在脂质和动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、细胞因子受体相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）（图2）；筛选到DElncRNA 13 个（上调9 个，下调4 个）（表1）。

表1 差异lncRNA列表Table 1 List of DElncRNAs

图1 AAA与AA差异基因筛选（图1A中绿色表示下调基因，红色为上调基因，黑色无差异基因；图1B中红色为上调基因，蓝色为下调基因） A：AAA与AA差异基因火山图；B：AAA与AA差异基因热图Figure 1 Identification of the differentially expressed genes between AAA and AA (green color represents down-regulated genes,the red color represents up-regulated genes,and black color represents no difference genes in figure 1A;red color represents the up-regulated genes and blue color represents the down-regulated genes in figure 1B)A: Volcano map of differentially expressed genes between AAA and AA;B: Heat map of differentially expressed genes between AAA and AA

图2 差异基因富集分析（颜色越红代表差异越显著，形状越大表示在该分子功能上富集越显著） A：GO 分析；B：KEGG 分析Figure 2 Enrichment analysis of the differentially expressed genes (the redder the color,the more significant the difference,and the larger the shape,the more significant of enrichment in the molecular function) A: GO analysis;B: KEGG analysis

2.3 基因诊断模型构建

利用Lasso 回归筛选差异基共得到17 个特异性基因模型（图3、表2）。

表2 AAA的17个特异性基因诊断模型Table 2 17 specific gene diagnostic models of AAA

图3 惩罚因素选择的交叉验证Figure 3 Cross-validation for the choice of penalty factors

2.4 基因诊断模型相关ceRNA 网络构建及关键ceRNA网络

由17 个基因诊断模型构建其参与到的ceRNA网络（图4A），利用cytoscape 中的cytoHubba 模块寻找关键ceRNA 网络，结果提示，lncRNA HCP5-miR-27a/b-FOSB 可能是AAA 发生发展最为关键的ceRNA网络（图4B）。

图4 基因诊断模型相关ceRNA 网络构建及关键ceRNA 网络分析（红色代表上调的基因，蓝色代表下调基因，绿色圆形为miRNA；方形为lncRNA，三角形为mRNA） A：AAA 特异性基因诊断模型参与的ceRNA 网络；B：AAA 关键ceRNA网络Figure 4 Establishment of ceRNA network involved in AAA-specific gene diagnosis model and analysis of key ceRNA network(red representing up-regulated genes,blue representing down-regulated genes,and green circles representing miRNAs;the square shapes representing lncRNAs,and the triangle representing mRNAs) A: The ceRNA network involved in AAA-specific gene diagnosis model;B: The key ceRNA network in AAA

3 讨论

AAA 是一种常见的、具有潜在致命性的血管退行性疾病[1,15]。在AAA 破裂前患者常无临床表现，老年患者中发病率及病死率较高[2-4]。病因较复杂，目前认为其与动脉粥样硬化关系最为密切，遗传因素、炎症、免疫、血流动力学等其他因素亦参与其中[16-18]。确切的致病机制上仍不明，充分了解AAA发生发展等相关的分子病理机制，不仅可用于疾病的早期诊断，同时也可能为治疗提供新的方案。

lncRNA 作为一类长链非编码的RNA 的总称，据研究报道其参与了多种肿瘤的发生发展[19-21]，且与某些疾病的预后有着密切的关系[22]。近年来，关于lncRNA 在AAA 的形成发展中的机制亦有诸多报道[23-26]，如缺氧诱发因子1α-AS1 是第一个被发现可促进胸腹部主动脉瘤的形成的lncRNA[27]；另外的研究发现，lncRNA GAS5 通过miR-185-5p/ADCY7 轴来影响血管平滑肌细胞的凋亡及炎症反应，进而调控AAA 的形成[26]；此外，Yang 等[28]采用测序数据识别了AAA 和正常腹主动脉间3 688 个不同表达的lncRNA，从分子层面为后期AAA 的研究奠定了基础，然而针对其分子作用及具体的机制却未能做出明确的解释。在本研究中，笔者借助生物信息学这一工具，分析了公共数据库GEO 中AAA 和AA 之间的差异基因，按照|logFC|＞1，P＜0.05这一标准，总共筛选出DEmRNA 114 个，DElncRNA 13 个，通过GO 及Kegg 富集分析进一步明确AAA 发生发展可能参与的重要的分子功能及信号通路，这同时也为AAA 后期基因层面的研究提供了重要的理论及数据支持。

目前，国内外期刊中关于AAA 中的特征性诊断基因的lncRNA 的模型研究较少[29-30]，仅一项研究通过荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术验证了lncRNA ENST00000566954、ENST00000580897和T181556 在AAA 与AA 之间的特异性表达；该项结论通过基础实验获得，结果可靠性较强，但研究者对其得出结论的过程却未能给出详细的描述[29]。在本研究中，笔者通过生物信息学手段筛选了114 个AAA 与AA 的DEmRNA，这些差异基因GO 和KEGG 富集分析显示其差异主要体现在脂质和动脉粥样硬化、细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路等。既往研究对AAA 形成的病理方面的变化包括VSMC 表型转换、VSMC 凋亡、炎症细胞浸润、ECM 重塑、强烈的氧化应激、EC 功能障碍、腔内血栓形成、主动脉壁的恶化等[5]。本研究所得富集分析结果显示与既往认识的AAA 的病理变化相类似，这也说明本研究筛选结果的准确性。为进一步明确AAA 的特征性基因，笔者通过Lasso回归筛选了17 个特异性的基因包括8 个上调基因，9 个下调基因，并构建了其参与的ceRNA 网络，最后揭示了lncRNA HCP5 可通过miRNA-27 来影响FOSB 的表达，同时也预测HCP5-miR27-FOSB 这条ceRNA 网络在AAA 发生发展起到尤为特异且关键的作用。

HCP5 已被证实参与了多种恶性肿瘤及自身免疫性疾病的发生，异常表达的HCP5 和疾病的预后有密切的关系[30-32]，亦可作为胃癌早期诊断的潜在标记物[33]，而在AAA 中的研究却鲜有报道。miR-27，主要包括有miR-27a 和miR-27b 两种，研究证实，其在血管内皮细胞及高度血管化组织中富集，具有促血管生成的作用[34]。目前对FSOB 的研究未有实质性的进展，仅作为诊断假肌源性血管内皮瘤的一种有效标志物[35-36]。而在本课题构建的基因模型中，FOSB 在AAA 较AA 组基因表达差异性最大，加之目前尚无FOSB 在AAA 中的研究报道，这值得进一步探究是否其参与到AAA 的形成及进展。

本研究有以下几点不足之处，其一，本研究来源于公共数据库，虽为降低误差笔者将两个公共数据库进行了合并分析，并做了批次化矫正，但并未在临床中收集样本做全基因测序来验证HCP5、miRNA-27 及FOSB 在AAA 中的表达情况。其二，未验证HCP5、miRNA-27 及FOSB 之间的动态变化情况；如敲低HCP5 对miRNA-27 及FOSB 的影响及对血管平滑肌细胞凋亡的影响，在后期可开展基础实验进一步来验证。

综上所述，本研究筛选的差异基因不仅从分子水平上揭示了AAA 发病机制，获得的DEmRNA，可作为后期AAA 治疗的潜在靶点，为AAA 的治疗打开新的思路，这也将是未来精准治疗发展的一种趋势。同时，诊断基因模型的构建筛选出了AAA的特征性基因，为AAA 早期诊断提供了依据；最后，ceRNA 网络HCP5-miR27-FOSB 可能在AAA 发生发展中起到尤为关键的作用，但这需要后续开展细胞、动物、组织学层面来进一步验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。