生物信息学分析导致类风湿关节炎性别差异的关键基因与信号通路①

苏思维 姜雯君 王晓颖 杜森 宋洪强

（山东第一医科大学暨山东省医学科学院，运动医学研究所，泰安 271000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种严重的慢性自身免疫性疾病，特征是持续性滑膜炎和系统性炎症。全球RA患者占成年人的0.5%~1.0%［1］。RA是导致严重肢体残疾的重要因素之一，给患者带来沉重的经济负担。有报告指出，RA会显著缩短患者的预期寿命［2］。目前，尚无治愈RA的方法，主要依赖于早期的发现和积极的治疗。因此，研究RA的分子机制和分析相关的信号通路，有利于发现更加有效的治疗靶点。

RA在性别上的差异是不容忽视的。有研究证实，女性患RA的概率是男性的3倍［3］。尽管性别的差异可能在导致自身免疫功能紊乱方面发挥复杂的作用，但迄今为止，性别因素与RA发病之间的联系尚不清楚［4］。因此，本研究的目的是通过全面的生物信息学分析，探讨RA发生发展在性别差异间的关键基因与途径，将有助于进一步了解RA发病的性别特异性，为RA提供潜在的生物学标志物和治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 资料来源从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下 载 基 因 表 达 谱GSE55457、GSE55584和GSE12021。筛选条件为：①RA；②人类；③滑膜。本研究纳入GSE12021数据集中7例正常男性滑膜样本，2例正常女性滑膜样本，3例男性RA滑膜样本，9例女性RA滑膜样本；GSE55457数据集中8例正常男性滑膜样本，2例正常女性滑膜样本，3例 男 性RA滑膜 样 本，10例女 性RA样本；GSE55584数据集中3例男性RA滑膜样本，7例女性RA样本。

1.2 数据整理及筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）使用R软件获取原始数据，采用log2变换进行归一化处理。将筛选出的样本合并后分为男性组：男性RA和男性健康对照；女性组：女性RA和女性健康对照进行两两比较。选择P≤0.05和|log2FC|≥1作为标准筛选DEGs。利用R软件中的ggplot2包制作DEGs火山图。

1.3 功能富集分析DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）是一个被广泛使用的在线数据库，DAVID数据库通过GO分析和KEGG通路分析为DEGs进行功能和通路富集分析［5-7］。为了获取DEGs的生物学功能和信号传导通路，本研究通过DAVID对DEGs进行GO分析和KEGG通路分析。

1.4 蛋白-蛋白相互作用分析本研究将所有的DEGs上传至STRING在线分析网站（https：//stringdb.org/）。以“combined score>0.7”作为筛选条件。导出分析结果通过Cytoscape软件3.60版本进行可视化处理［8］，并采用cytoHubba插件根据“Degree”算法，筛选出PPI网络中前5个关键基因。

1.5 模块化分析Cytoscape软件中的MCODE插件被用来筛选PPI网络中的密集连结区域［9］。本研究使用MCODE从构建的PPI网络中获取核心模块。参数设置标准为：node score cutoff=0.2，K-core=2，degree cutoff=2。此外，对模块分析结果进行进一步通路富集分析，P≤0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DEGs将GSE55457、GSE55584和GSE12021数据集筛选整理后进一步差异分析得到男性组：RA 9例，正常15例，女性组：RA 26例，正常4例。其中男性组中高表达基因416个，低表达基因336个，女性组中高表达基因744个，低表达基因309个。火山图如图1所示，红色代表高表达的基因，蓝色代表低表达的基因。

图1 GSE55457、GSE55584和GSE12021的DEGs火山图Fig.1 Volcano plots of DEGs of GSE55457，GSE55584 and GSE12021

2.2 DEGs GO分析GO富集分析结果显示，男性组DEGs主要参与的生物学过程包括免疫应答、细胞-细胞信号转导、RNA聚合酶Ⅱ转录的正调控等；细胞组成包括胞外区、细胞膜外侧、细胞膜的组成成分等；分子功能包括细胞因子活性、转录激活因子活性、serine-type肽链内切酶活性等。女性组DEGs主要参与的生物学过程包括免疫反应、炎症反应、趋化因子介导的信号通路等；细胞组成上包括细胞膜的组成成分、细胞膜、细胞外区等；分子功能包括趋化因子活性、C-C趋化因子受体活性、肝素结合等。见图2和表1、表2。

表1 前5女性DEGs GO富集分析Tab.1 Top 5 GO enrichment analysis of DEGs in females

表2 前5男性DEGs GO富集分析Tab.2 Top 5 GO enrichment analysis of DEGs in males

图2 不同性别DEGs的前5个GO富集分析Fig.2 Top 5 GO enrichment analysis of DEGs in females and males

2.3 KEGG信号通路分析采用KEGG途径富集分析来了解DEGs信号通路的富集情况，以P≤0.05为临界值。KEGG通路分析显示，男性组DEGs主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、人类嗜T细胞病毒（human T cell leukemia virus type-Ⅰ，HTLV-Ⅰ）感染、造血细胞谱系等通路中。KEGG通路分析显示，女性组DEGs主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、原发性免疫缺陷等通路中，见图3和表3、表4。

表3 前5女性DEGs KEGG通路分析Tab.3 Top 5 KEGG pathway analysis of DEGs in females

表4 前5男性DEGs KEGG通路分析Tab.4 Top 5 KEGG pathway analysis of DEGs in males

图3 不同性别DEGs的前5个KEGG通路分析Fig.3 Top 5 KEGG pathway analysis of DEGs in females and males

2.4 PPI网络分析 本研究使用在线工具STRING数据库构建PPI网络分析DEGs之间的相互作用。将得到的PPI网络导入Cytoscape 3.6.0工具，筛选出各组degree得分前5位基因，其中男性组前5位关键基因是IL-6、MYC、EGFR、FOS和JUN；女性组中前5位关键基因是IL-6、ALB、PTPRC、CXCL8和CCR5，见附图1（www.immune99.com）。

2.5 模块分析采用Cytoscape软件构建DEGs的PPI后，用MCODE插件获取各组核心模块，并对该模块中的基因进行KEGG分析。KEGG富集分析表明，男性组核心模块的基因主要参与趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和Toll样受体信号通路相关；女性组核心模块的基因主要与趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和神经活性配体-受体相互作用相关，见图4。

图4 PPI网络的核心模块及其KEGG通路分析Fig.4 Clusters of PPI networ and KEGG pathway analysis

3 讨论

本研究从GEO数据库中下载GSE55457、GSE55584、GSE12021基因表达谱数据，并进行数据筛选和整理得到男性组：RA 9例，正常15例，女性组：RA 26例，正常4例。其中男性组中高表达基因416个，低表达基因336个，女性组中高表达基因744个，低表达基因309个。在本研究中，DEGs的KEGG通路分析显示，在男性中主要富集通路是细胞因子-细胞因子受体相互作用、HTLV-Ⅰ感染、造血细胞谱系、原发性免疫缺陷和癌症通路。KEGG通路分析显示，在女性中富集的通路主要有细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、原发性免疫缺陷、造血细胞谱系。HTLV-Ⅰ感染和趋化因子信号通路已经被证明参与了RA的发病［10-12］。HTLV-Ⅰ是一种人类逆转录病毒，HTLV-ⅠTax可诱导NF-κB活化宿主细胞。此外，Tax介导的NF-κB活化涉及HTLV-Ⅰ感染细胞对凋亡刺激的抵抗。HTLV-ⅠTax的这些调节作用被认为具有促进HTLV-Ⅰ血清阳性受试者自身免疫性疾病，如RA的重要作用［13］。此外，尚未有研究探讨性别在RA相关通路中的作用，本研究发现，在RA男性和女性发病过程中有着相同的信号通路，如细胞因子-细胞因子受体相互作用、造血细胞谱系与原发性免疫缺陷等，但目前尚无文献研究这些信号通路与RA发病之间的关系。

通过PPI网络分析得到，男性组中关键基因为IL-6、MYC、EGFR、FOS和JUN，女性组中关键基因为IL-6、ALB、PTPRC、CXCL8和CCR5，其中IL-6在男性和女性组中均被鉴定为关键基因，而其他关键基因在男性组和女性组之间完全不同。EGFR在肿瘤生长过程中起着重要作用［14］。与肿瘤生长相似，RA中EGFR及其配体的上调将导致RA滑膜的增生和侵袭［15］。动物实验表明，通过药物调控EGFR或其配体可能是治疗RA的有效方法［16］。由JUN蛋白和FOS蛋白组成的二聚体复合体AP-1是细胞核中重要的转录因子。c-Fos/AP-1可以控制炎症因子IL-1β和基质金属蛋白酶的表达［17］。IL-1β是多种基质金属蛋白酶最重要的诱导剂，与软骨破坏和破骨细胞生成密切相关［18］。此外，IL-1β和c-Fos/AP-1相互影响基因表达和活性，加重RA的进展。PTPRC，又称CD45，是经典的蛋白酪氨酸磷酸酶，在所有造血源有核细胞中表达［19］。蛋白酪氨酸蛋白磷酸酶是T细胞抗原受体激活T细胞所必需的，一些风险等位基因已经被确认与RA发病的增加有关，而PT⁃PRC的上调可能有利于维持正常滑膜功能［20］。趋化因子是细胞黏附和细胞运输的主要调控因子，具有诱导附近应答细胞定向趋化的能力［21］。CXCL8作为炎症介质，在成纤维细胞和单核细胞等细胞中表达，并作为中性粒细胞的趋化因子，导致中性粒细胞在炎症部位（如RA患者的炎症关节）聚集［22］。CCR5是细胞内β趋化因子的受体，调节T细胞和巨噬细胞的迁移、增殖和免疫，CCR5主要表达于单核细胞和未成熟树突状细胞的细胞膜上［23］。CCR5及其配体除了是早期HIV-1感染所必需的共受体外，还在RA和系统性红斑狼疮中发挥重要作用［24-26］。此外，对PPI网络进行模块化分析，发现男性组核心模块KEGG分析主要与趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和Toll样受体信号通路有关；女性组核心模块KEGG分析主要与趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、神经活性配体-受体相互作用有关。

综上所述，本研究使用生物信息学技术整合3个RA表达谱芯片，分别对男性和女性RA患者的DEGs进行分析，得到了不同的关键基因，本研究发现了导致男性和女性RA发病机制差异的相关证据，为RA的治疗提供了更有前景的治疗靶点。