双氢青蒿素对CNP模型大鼠的治疗作用及对炎症小体NLRP3信号通路的影响①

杜菲 周岩 王军浩 韩建鹏 冯建勇 郭阔 陈文彬 李永章

（河北省中医院泌尿外科，石家庄 050011）

慢性前列腺炎（chronic prostatitis，CNP）是男性常见病，临床表现为慢性盆腔疼痛、尿急、尿痛、排尿不尽感、排尿困难等尿道刺激或梗阻症状［1］；CNP发病率高，治愈率低，且持续时间长，易反复，对患者身心造成严重危害［2-3］。迄今为止，CNP的诊断标准、治疗方法及疗效评判标准均存在不足，CNP的致病机制和治疗方法急需进一步研究。双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素被硼氢化钠还原生成的衍生物，疗效强而副作用小，除具有治疗疟疾、抗肿瘤等作用外，还具有抗炎作用［4］。但DHA是否对CNP有治疗作用尚不清楚。本研究以健康雄性SPF级SD大鼠复制CNP模型，旨在观察DHA对CNP模型大鼠的治疗作用及对炎症小体NLRP3信号通路的影响，为CNP治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物健康雄性SPF级SD大鼠36只，6周龄，体质量180~200 g，购于成都达硕生物有限公司［SCXK（川）2020-030］。

1.1.2 试剂与仪器苯甲酸雌二醇（Sigma，CAS#：50-50-0）；TNF-αELISA试剂盒（#ab181421）、IL-10 ELISA试 剂 盒（#ab255729）、IL-6 ELISA试 剂 盒（#ab46027）、caspase-1、IL-1β（英国Abcam公司）；抗NLRP3（中国Bioss公司）；酶标仪（美国BioTek Elx9808）；倒置显微镜（德国Zeiss）。

1.2 方法

1.2.1 分组实验动物随机放入鼠笼中适应性饲养3 d，第4天挑选健康雄性SPF级SD大鼠36只用于实验，随机取6只大鼠作为对照组（Control），其余30只用于构建CNP模型，对照组实行假手术。CNP模型建立后，随机选择24只大鼠分为4组：模型组（Model）、DHA高剂量组（High-DHA）、DHA低剂量组（Low-DHA）和前列康组（QLK），每组6只，其中模型组不采取治疗，DHA高、低剂量组每天灌胃给予40、20 mg/kg DHA，前列康组每天灌胃给予0.5 g/kg前列康片，连续治疗1个月，空白组和模型组每天灌胃给予等量生理盐水。

1.2.2 CNP模型构建采用去势和雌激素诱导的方式建立CNP模型［5］。大鼠造模前12 h禁食不禁水，造模开始时腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，大鼠完全昏迷后固定，剔除腹部全部毛发，消毒。无菌条件下在腹中线位置开口，将两侧睾丸分别挤出阴囊，结扎后剪断精索血管，缝合消毒后将大鼠放入鼠笼中等待苏醒。第2天在腹部皮下注射苯甲酸雌二醇（0.35 mg/kg，溶于橄榄油），1次/d，连续20 d。每天用碘伏擦拭伤口，肌内注射青霉素1周（200 000 U/kg）。空白组假手术处理，除不挤出阴囊和剪断精索血管外，其余操作同CNP造模。

1.2.3 von Frey纤维检测痛觉敏感性及前列腺指数计算采用von Frey丝（4 g）测试大鼠痛觉敏感性，刺激范围局限于前列腺附近盆腔区域。1~2 s/次施加刺激，间隔至少5 s，共10次，若大鼠出现腹部剧烈收缩、舔或抓挠及跳跃等剧烈动作，则被认为积极响应。统计结果以正响应百分比计算，即响应频率（%）。大鼠称重，颈椎脱位处死，取前列腺组织并称重。前列腺指数（mg/g）=前列腺重（mg）/大鼠体质量（g）。

1.2.4 HE染色10%多聚甲醛固定大鼠前列腺组织，乙醇脱水，二甲苯清除，石蜡包埋，切片，按照常规方法进行HE染色，显微镜下观察。

1.2.5 ELISA采用50 mmol/L冷磷酸钾缓冲液（pH=7.4）制备前列腺匀浆（10%，W/V），4℃、3 000 r/min离心10 min，采集上清进行ELISA分析。TNF-α、IL-10和IL-6含量分别采用ELISA试剂盒检测，按照试剂盒说明书操作。

1.2.6 Western blot提取前列腺组织总蛋白，Bradford's法测定蛋白质浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转膜（PVDF），5%牛血清白蛋白（BSA）孵育，4℃孵育一抗，TBST洗涤3次，孵育二抗，显色，Bio-Rad全功能成像系统采集图像，Image J软件分析光密度，以β-actin为内参，计算前列腺组织NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白相对表达。

1.3 统计学处理采用SPSS19.0软件进行数据分析，结果以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DHA对CNP模型大鼠痛觉敏感性的影响

von Frey纤维检测大鼠痛觉敏感性，结果显示，与对照组相比，模型组大鼠痛觉响应频率显著升高；与模型组相比，DHA高、低剂量组与前列康组大鼠痛觉响应频率均显著降低，其中DHA高剂量组和前列康组大鼠痛觉敏感性改善效果比DHA低剂量组更为显著（表1）。

表1 各组大鼠反应频率（±s，n=6）Tab.1 Response frequency of rats（±s，n=6）

表1 各组大鼠反应频率（±s，n=6）Tab.1 Response frequency of rats（±s，n=6）

Note：1）P<0.001 vs control group；2）P<0.01，3）P<0.001 vs model group；4）P<0.01 vs low-DHA group.

Groups Control Model Low-DHA High-DHA QLK Response frequency（%）26.67±8.16 85.00±10.491）70.00±6.322）55.00±5.483）4）53.33±10.333）4）

2.2 DHA对CNP模型大鼠前列腺指数的影响与对照组相比，模型组大鼠体质量显著降低，前列腺重和前列腺指数显著升高；与模型组相比，3个治疗组体质量均显著增加，前列腺重和前列腺指数降低，与DHA低剂量组相比，DHA高剂量组和前列康组大鼠体质量显著增加，前列康组前列腺指数显著降低（表2）。

表2 大鼠体质量、前列腺重及前列腺指数（±s，n=6）Tab.2 Body weight，prostatic weight and prostatic index of rats（±s，n=6）

表2 大鼠体质量、前列腺重及前列腺指数（±s，n=6）Tab.2 Body weight，prostatic weight and prostatic index of rats（±s，n=6）

Note：1）P<0.001 vs control group；2）P<0.05，3）P<0.001 vs model group；4）P<0.05，5）P<0.01，6）P<0.001 vs low-DHA group.

Groups Control Model Low-DHA High-DHA QLK Body weight/g 310.78±8.46 258.25±7.421）269.23±8.432）287.27±5.453）6）284.78±2.543）5）Prostate weight/mg 639.43±47.86 832.37±71.871）686.12±5.653）669.38±48.043）633.87±60.533）Prostate index/（mg·g-1）2.06±0.18 3.23±0.301）2.55±0.083）2.33±0.203）2.23±0.213）4）

2.3 DHA对CNP模型大鼠前列腺组织病理损伤的影响HE染色发现，对照组前列腺组织结构完整清晰，未见明显病理变化；模型组前列腺组织结构受损，腺管结构模糊，大量腺管萎缩，腔内分泌物基本消失，间质内可见大量纤维组织，部分区域可见淋巴细胞或巨噬细胞聚集；与模型组相比，3个治疗组前列腺组织结构损伤程度减轻，腺腔内分泌物增加，其中，DHA高剂量组和前列康组腺腔内分泌物恢复更为明显（图1）。

图1 HE染色观察大鼠前列腺组织病理损伤Fig.1 Pathological lesions of prostate tissues observed by HE staining

2.4 DHA对CNP模型大鼠前列腺中炎症因子的影响ELISA结果表明，与对照组相比，模型组大鼠前列腺组织中TNF-α和IL-6含量显著升高，IL-10含量显著降低；与模型组相比，DHA高剂量组及GLK组TNF-α和IL-6含量显著降低，IL-10含量增加，但3个治疗组间前列腺组织TNF-α、IL-6和IL-10含量差异无统计学意义（表3）。2.5 DHA对CNP模型大鼠前列腺组织炎症小体NLRP3信号通路的影响Western blot结果表明，与对照组相比，模型组大鼠NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达显著升高，与模型组相比，DHA高、低剂量组NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达均显著降低，但两组间差异无统计学意义（图2）。

表3 大鼠前列腺组织TNF-α、IL-10、IL-6含量（±s，n=6，pg/ml）Tab.3 TNF-α，IL-10 and IL-6 contents in prostate tissues of rats（±s，n=6，pg/ml）

表3 大鼠前列腺组织TNF-α、IL-10、IL-6含量（±s，n=6，pg/ml）Tab.3 TNF-α，IL-10 and IL-6 contents in prostate tissues of rats（±s，n=6，pg/ml）

Note：1）P<0.01 vs control group；2）P<0.05，3）P<0.01 vs model group.

Groups Control Model Low-DHA High-DHA QLK IL-6 28.243±0.737 31.765±1.2601）31.028±1.323 29.314±0.8982）29.836±0.3142）IL-10 5.868±0.211 5.162±0.1841）5.410±0.231 5.794±0.0803）5.642±0.0993）TNF-α 46.148±1.309 51.895±2.0531）49.882±1.921 48.403±1.2552）48.547±0.3612）

图2 Western blot检测NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表达Fig.2 Western blot detected NLRP3，caspase-1，IL-1β protein expressions

3 讨论

本研究采用去势和雌激素诱导的方式建立CNP模型，结果显示，与对照组相比，模型组大鼠痛觉敏感性、前列腺重和前列腺指数显著升高，体质量减少，前列腺组织结构受损严重，说明CNP大鼠模型建立成功。分别采用40、20 mg/kg DHA及前列康片治疗后，CNP大鼠以上症状均得到明显改善。前列康片是临床CNP治疗的常用药，40 mg/kg DHA表现出了与前列康片相似的治疗效果，表明DHA有望成为新的CNP治疗药物。

虽然CNP的具体发病机制尚不清楚，但越来越多的研究表明炎症在CNP中起关键作用［6-7］。XIONG等［6］研究表明，CNP大鼠血清炎症因子IL-6、IL-8和IL-17表达显著上升，八正散降低了IL-6、IL-8和IL-17表达，表明八正散的抗炎作用是治疗CNP的途径之一。本研究表明，DHA和前列康片均降低了促炎因子TNF-α和IL-6表达，提高了抑炎因子IL-10表达，表明调控炎症因子表达、抑制炎症反应可能是DHA和前列康治疗CNP的作用靶点。

NLRP3炎症小体激活是各种炎症反应的关键步骤，可能是抗炎治疗的一个有前途的靶点［8-10］。细胞损伤过程中衍生的脂多糖和其他分子可促进NLRP3炎症小体激活，从而导致caspase-1激活；活化的caspase-1最终将内源性促炎细胞因子IL-1β和IL-18转化为成熟的分泌形式［8，11-13］。研究表明，CNP大鼠前列腺组织中NLRP3信号通路被激活，血清IL-1β和IL-18水平升高，可能是大鼠前列腺炎症细胞浸润和组织学改变的原因之一［14-15］。DHA是从青蒿素中提取的倍半萜内酯，具有抗炎和抗癌作用。LIANG等［16］通过网络药理学方法发现，DHA可通过抑制NLRP3炎症小体激活预防葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎。但DHA在CNP中对NLRP3炎症小体通路的作用尚无报道。本研究证实，40、20 mg/kg DHA均能显著抑制NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表达，说明DHA可通过抑制NLRP3炎症小体通路激活，减少炎症细胞因子分泌，从而缓解CNP的炎症组织病理损伤。虽然DHA具有抑制NLRP3炎症小体改善CNP炎症反应的作用，但DHA对包括NLRP3炎症小体在内的炎症反应信号的分子调控机制有待进一步研究。