温阳利水煎对慢性心力衰竭心肌重构钙调磷酸酶信号通道的影响*

任得志 张军茹 张笑峥 苏亚秦 天津中医药大学(天津 300193)

温阳利水煎对慢性心力衰竭心肌重构钙调磷酸酶信号通道的影响*

任得志 张军茹△张笑峥△苏亚秦△天津中医药大学(天津 300193)

目的：观察温阳利水煎对钙调磷酸酶-活化T细胞核因子3(CaN-NFAT3)信号通路中关键分子表达的影响，揭示其治疗心力衰竭的机制。方法：SD大鼠60只, 除空白对照组(n=10)外,其余50只采用连续腹腔注射阿霉素的方法复制大鼠慢性心力衰竭模型, 待造模成功后将动物分为模型对照组、温阳利水煎治疗组 (高、中、低剂量组 )与阳性对照组(地高辛组), 用温阳利水煎药液治疗6周后, 测定左室及右室质量指数，用免疫组化法检测CaN、NFAT3在心肌组织中的表达。结果：慢性心力衰竭大鼠经温阳利水煎治疗,心肌细胞的变性坏死得以改善,治疗组左室及右室质量指数、CaN、NFAT3表达均低于模型组。结论：温阳利水煎可抑制CaN、NFAT3在心肌组织中的表达，这可能是该药治疗慢性心力衰竭作用机制之一。

慢性心力衰竭(Chronic Heart failure,CHF)是各种心脏疾病导致心功能不全的临床综合征。基本所有的心脏疾病发展到终末阶段都将导致急慢性心力衰竭，其具有致残率及死亡率高的特点。因此，慢性心力衰竭的防治成为新近研究的热点。心肌重构是CHF的病理生理基础，目前认为钙调磷酸酶-活化T细胞核因子3(CaN-NFAT3)介导的信号通道在心肌细胞肥厚的发生发展中起至关重要的作用[1-3]，阻断该信号通道可以抑制心肌细胞的肥厚，从而延缓心肌重构及其心力衰竭的进展。本文旨在通过建立大鼠心力衰竭模型，观察温阳利水煎对CaN-NFAT3信号通道的干预作用，探讨其治疗心力衰竭的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康纯种SD大鼠，体重180±20g，由西安交通大学医学院实验中心提供。动物许可证号SCXK(陕)2012-009。

1.2 药物及制备 温阳利水煎(黄芪、茯苓、丹参、防己、葶苈子、车前子、附片、桂枝) ，由陕西省中医医院药剂科提供；地高辛( 赛诺菲杭州制药有限公司，国药准字320H183)。

1.3 主要试剂与仪器 普通光学显微镜(型号Motic BISERES,日本奥林巴斯公司)；Motic Med 6.0数码医学图像分析系统(A)(厦门麦克奥迪公司)；FA2004电子分析天平(上海光学仪器厂)；大鼠CaN、 NFAT3 ELISA试剂盒(上海西诺生物科技有限公司)。

2 实验方法

2.1 动物分组及给药 SD大鼠60只, 除空白对照组(n=10)外,其余50只采用连续腹腔注射阿霉素的方法复制大鼠慢性心力衰竭模型, 造模结束后肉眼观察大鼠状态，若在静息状态下出现精神不振、脱毛、呼吸困难、大便溏泻、肛周污染、腹腔积液等症状,表明慢性心力衰竭造模成功[4],在造模过程中死亡大鼠共5只,解剖发现均存在多浆膜腔积液及脏器充血，待造模成功后将动物随机分为模型对照组、温阳利水煎治疗组 (高、中、低剂量组 )与阳性对照组(地高辛组), 各组实验大鼠除自由饮食外，空白对照组和模型对照组每天以2mL蒸馏水灌胃1次，温阳利水煎高、中、低剂量组每天以4mL、2mL、1mL药液灌胃1次，地高辛组灌服0.25mg/kg，1d1次，2月后观察各项指标。

2.2 标本采集 大鼠处死后,取出心脏,用生理盐水将其冲洗干净,分别称其左室、右室重量，然后4%多聚甲醛固定24h后酒精脱水、透明、石蜡包埋，超薄切片，进行HE染色，CaN和NFAT3均采用S-P法，按免疫组化试剂盒说明进行。

3 结 果

3.1 一般情况观察 温阳利水煎高剂量组共死亡 1只, 中剂量组死亡 2只, 低剂量组死亡 1只, 模型对照组死亡2只，阳性对照组死亡1只。用药组大鼠精神情况明显好于模型对照组。

3.2 心肌重构指标变化 与空白对照组相比，模型组左室、右室质量指数增大明显，差异具有统计学意义(P<0.01 )；与模型组相比，温阳利水煎各组和地高辛组左室、右室质量指数均显著降低，差异具有统计学意义(P< 0.05 )； 与地高辛组比较，温阳利水煎低剂量组左室、 右室质量指数升高， 差异具有统计学意义(P< 0.05 )；而温阳利水煎高、中剂量组与地高组比较，差异无统计学意义(P>0.05 )，见表1。

表1 各组心肌重构指标测定±s)

注：与空白组比较，▲P<0.01；与模型组比较,△P<0.05；与地高辛组比较,◇P<0.05

3.3 心肌组织中CaN、NFAT3的表达 见表2。

表2 心肌组织中CaN、NFAT3的表达

注：与空白组比较，▲P<0.01；与模型组比较,△P<0.05；与地高辛组比较,◇P<0.05

与空白对照组相比，模型组CaN、NFAT3在心肌细胞的积分光密度值显著增高，差异具有统计学意义(P<0.01 )；与模型组相比较，温阳利水煎各组和地高辛组CaN、NFAT3的积分光密度值均减低，差异具有统计学意义(P< 0.05 )； 与地高辛组比较，温阳利水煎中、低剂量组CaN、NFAT3的积分光密度值升高， 差异具有统计学意义(P< 0.05 )；而温阳利水煎高剂量组与地高辛组比较，差异无统计学意义(P>0.05 )。

4 讨 论 现代医学对心力衰竭病理生理机制研究有了显著进展，已明确认识心力衰竭发生发展的基本机制是心肌重塑，目前认为钙调磷酸酶-活化T细胞核因子3(CaN-NFAT3)介导的信号通道在心肌细胞肥厚的发生发展中起至关重要的作用[1-3]，阻断该信号通可以抑制心肌细胞的肥厚，从而延缓心肌重构及其心力衰竭的进展。心力衰竭近几年治疗虽取得疗效，但其远期疗效不能令人满意，死亡率仍居高不下，且西药毒副作用相对较大，其对各种舒张功能不全的心力衰竭的治疗几乎没有特效药[5]。而中医对心力衰竭的证候研究、病因病机的探讨以及治疗方面都积累了一定经验，与西医相比具有独特的优势，对收缩性和舒张性的急慢性心力衰竭均有明显的疗效，明显改善患者的生活质量。

温阳利水煎是我省名老中医苏亚秦主任医师在长期临床应用的基础上创制的，其认为心力衰竭主要是心肺脾肾四脏阳气受损，致使气化失司、血瘀脉阻、水湿内停等本虚标实改变有关。治宜温阳益气治其本，利水消肿治其标，以活血化瘀贯串治疗始终。前期药理学和临床证实其主要有正性肌力、扩张阻力血管、明显改善肺循环的作用，从而显著改善心脏整体功能，减轻肺水肿，减少胸腹腔渗液量，纠正心力衰竭[6]，但就其具体机制尚不清楚。本研究结果显示，温阳利水煎能明显降低心衰大鼠左、右心室质量指数，改善心肌重构，同时，本课题从CaN-NFAT3介导信号通道这一分子生物学机制入手，表明温阳利水煎能明显抑制心力衰竭大鼠心肌细胞CaN 及 NFAT 3 的表达，从而抑制心肌重构，改善心衰，这可能是该药治疗慢性心力衰竭作用机制之一。

[1] Berry JM，LeV，Rotter D，Battiprolu PK，et al. Reversibility of adverse， calcineurin-dependent cardiac remodeling [J]. CircRes，2011，109(4)：407-417.

[2] Rao A. Signaling to gene expression：calcium，calcineurin and NFAT[J]. Nat Immunol，2009，10(1)：3-5.

[3] 崔国明，东 燕，赵 勇，等. 钙调神经磷酸酶表达与心脏重构的关系[J]. 中华实用诊断与治疗杂志，2012，25(8)：758-759.

[4] Dang Wantai,Miao Weina, Yang Xiaofang,et al.The targeting study about CaN in regulation of heart failure by fuzinoside[J].Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica，2011，27(2):59-62.

[5] 喻本桐，骨髓干细胞心肌移植治疗缺血性心脏病的研究进展[J].陕西医学杂志，2006,35(2):236-238.

[6] 苏亚秦. 温阳利水煎治疗充血性心力衰竭30例[J].陕西中医，2004,15(3):98-99.

(收稿2014-08-11；修回2014-09-24)

The effects of Wenyang Lishui decoction on calcineurin signal pathway of rats with chronic heart failure

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine(Tianjin 300193)

Ren Dezhi Zhang Junru Zhang Xiaozheng et al

Objective：To observe the effect of wenyang lishui decoction calcineurin signal pathway of rats with chronic heart failure to explore the possible mechanism on treatmenting heart failure. Method：Except for the blank group(n=10) ,Adria mycin was given intraperitoneally to fifty SPF grade SD rats to copy the model of heart failure . The heart failure rats were divided into model group,wenyang lishui decoction treating group( high , middle and low dose group) and the positive control group(dioxin group). Giving wenyang lishui decoction to the treatment group for 6 weeks , then detect the the left ventricular weight index,right ventricular weight index,CaN and NFAT 3 protein expression. Results：After treatmen, the indexes of hemodynamics in heart failure rats can be improved ,The levels of left ventricular weight index,right ventricular weight index,CaN and NFAT 3 protein expression in treatment significantly reduced.Conclusions：Wenyang lishui decoction can inhibit the expressions of CaN and NFAT3 in the cardiac index, and this maybe a mechanism in postponing the process of the heart failure.

Chronic heart failure/traditional Chinese medicine therapy Wenyang lishui decoction Immunohistochemistry Animal Experimentation Rats

*陕西省自然科学基础项目(2014JM4147)

心力衰竭/中医药疗法 温阳利水 免疫组织化学 动物实验 大鼠

R54

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.01.059

△陕西省中医医院(西安 710003)