丙酮酸脱氢酶激酶4与非小细胞肺癌耐药研究进展

王雪纯 梁爱玲 刘勇军

1广东省医学分子诊断重点实验室（广东东莞 523808）；2广东医科大学医学技术学院（广东东莞 523808）；3广东医科大学生物化学与分子生物学教研室（广东东莞 523808）

2021年的GLOBOCAN全球癌症统计数据显示，2020年肺癌成为世界第二常见的癌症，但肺癌仍然是癌症死亡的主要原因，在2020年约有180万人死亡，占全部癌症死亡病例的18%。在男性中，肺癌的发生率（14.3%）和死亡率（21.5%）都高居榜首。在女性中，肺癌发生率（8.4%）仅次于乳腺癌（24.5%）和结直肠癌（9.4%），死亡率（13.7%）仅次于乳腺癌（15.5%），成为女性癌症中的第二大杀手［1］。在我国，肺癌是整个人群中最常见的恶性肿瘤，同时也是男性最常见的癌症［2］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占比超过肺癌总体五分之四，因其患病群体庞大而倍受关注。近年来随着诊断技术和治疗手段的提高，NSCLC患者的生存率提高［3］，但尽管面对越来越强的靶向治疗，耐药细胞的出现仍是无可避免［4］。

肿瘤的发生发展和糖代谢密切相关，代谢物交换和细胞间通讯造成的肿瘤代谢异质性在促进转移中起着重要作用，并导致临床耐药性，因代谢而改变的肿瘤微环境对于肿瘤的生长、转移和耐药也起着不可忽视的作用［5］。丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）作为丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinases，PDKs）家族四大亚型的一员，与其他亚型的相同之处是：皆可通过使丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDH）失去活性，导致丙酮酸进入乳酸代谢途径，但PDK4相较于其他亚型以其能够磷酸化多个PDH位点的特性，在肿瘤防治中更具吸引力。PDK4既有致癌作用，又有抑癌作用，且其在肿瘤中的异常表达与耐药的发生也有着密切的联系［6］。

1 PDK4概述

人体正常组织中，丙酮酸在PDH的催化下变成乙酰辅酶A，从而进入三羧酸循环为组织供能。但在肿瘤细胞中，PDH的催化作用常常受到抑制，其活性的降低将会促进肿瘤细胞的有氧糖酵解，即Warburg效应。这种效应能够促进肿瘤生长和转移，重要原因之一是活性氧（reactive oxygen species，ROS）的降低［7］。PDH被PDKs磷酸化利于Warburg效应的进展，即促进细胞能量代谢倾向于乳酸的生成而非TCA循环［8］。以阿拉伯数字1-4命名的四种PDK亚型已经在哺乳动物组织中得到鉴定，并在众多研究中被预测为各种恶性肿瘤、糖尿病、肥胖症和心力衰竭等一系列人类顽疾的药物靶点，这些PDKs作为线粒体激酶，磷酸化多个PDH位点从而转换着不同的代谢方式［9］。

PDK4存在于线粒体基质，是一种线粒体蛋白。过去对PDK4的研究常常围绕其在糖尿病代谢调节［10］中的作用并与神经性疼痛［11］、动脉粥样硬化患者血管钙化［12］等方面有关。现在认为PDK4参与真核生物的许多生理和病理过程，特别是PDK4异常表达导致许多癌症的发生和发展［13］。

2 PDK4与肿瘤

2.1 PDK4与肿瘤增殖 PDK4作为有氧糖酵解的关键参与者，在除肝癌外多种恶性肿瘤中高表达并被证实为致癌基因。2018年，GUDA等［14］发现PDK4在乳腺癌细胞中异常高表达，并与miR-211水平呈负相关。miR-211过表达降低了乳腺癌细胞的细胞外酸化率，并将能量来源转移到线粒体的氧化磷酸化，降低了PDK4的表达水平。这可能使得靶向miR-211抑制PDK4成为乳腺癌治疗的新策略。LI等［15］研究表明N6-甲基腺苷（N6-adenosine-methyl，m6A）可以正向调节宫颈癌和肝癌细胞中PDK4的表达，促进肿瘤细胞的有氧糖酵解，加速肿瘤细胞的增殖并影响到癌细胞的化疗敏感性，严重影响患者预后。这说明RNA修饰和细胞代谢之间可能存在某种联系，对于未来揭示肿瘤内在转录与代谢的交叉调控有一定启示作用。LIU等［16］也同样发现PDK4在宫颈癌细胞中高表达，且PDK4与长链非编码RNA LINC00662呈正相关，LINC00662可通过上调PDK4的表达促进宫颈癌细胞增殖和侵袭。MIAO等［17］发现抑制miR-5683可以上调PDK4的表达促进有氧糖酵解，从而增强了胃癌细胞的增殖并减少凋亡，因此过表达miR-5683可能成为胃癌治疗的新方法。2021年LIU等［18］同样发现PDK4高表达，并且这种高表达与胃癌细胞增殖相关的各种生物学行为，以及胃癌患者的患病程度和预后有着高度联系，这为设计新的胃癌治疗手段提供了新的路径。在2022年发表的新研究［19］中，PDK4被鉴定为与人类前列腺癌（prostate cancer，PC）相关的miR-32靶点，并在PC中低表达。高表达的miR-32抑制了PDK4表达且诱导了PC更高的代谢活性，反之，过表达PDK4降低了糖酵解速率并能抑制PC细胞生长。2020年DUAN等［20］实验发现，经过一种名为邻苯二甲酸丁苄酯（又名BBP）的致癌化学药品处理后，能够增加急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）细胞中PDK4的表达，并促进细胞的有氧糖酵解。抑制PDK4可抑制BBP诱导的AML细胞增殖。上述研究几乎一致表明通过PDK4高表达促进了有氧糖酵解，增加了乳酸生成和减少线粒体能量代谢，表现出促癌作用。尽管大多数研究认为高表达的PDK4有致癌作用，但也有研究发现在肝癌细胞中PDK4是低表达，在体外通过促进细胞线粒体功能来促进肝癌细胞的增殖。2021年SI等［21］研究表明 miR-9-5p直接靶向 PDK4下调其表达，促进肝癌细胞线粒体能量代谢，进一步促进细胞增殖和细胞周期进入，加速了肝癌的发展。

2.2 PDK4与肿瘤侵袭、迁移 PDK4在乳腺癌、膀胱癌，甲状腺癌细胞中的异常表达不仅能够促进细胞的恶性增殖，还有助于肿瘤细胞的迁徙和转移。LECLERC等［22］观察到PDK4的表达在结直肠癌转移细胞和患者外周血中显著升高并伴随PDK甲基化水平的降低，降低PDK4的表达使hif1基因的表达下调，而HIF-1作为血管内皮生长因子的主要激活因子能够增加结直肠癌细胞的迁移和侵袭特性。这说明在结直肠癌细胞中降低PDK4的表达降低结直肠癌细胞的迁移和侵袭，提示PDK4与结直肠癌细胞的迁移和侵袭有一定的关联。并且直接检测外周血PDK4甲基化水平也为诊断结直肠癌增加了新的维度。另有研究［23］发现环状RNAcircCCDC66可通过miR-211-5p/PDK4轴促进甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。circCCDC66可能通过海绵作用降低miR-211-5p的表达，促进PDK4的表达，从而影响甲状腺癌细胞的增殖和侵袭性。关于PDK4表达水平与癌细胞侵袭程度成正比的例子不胜枚举，但也有实验证明miR-9-5p是通过下调PDK4促进肝癌细胞线粒体能量代谢，促进肝癌的增殖、侵袭和迁移［21］。PDK4在不同肿瘤中的不同效果证明了它功能的复杂性，但其内在分子机制仍未十分清楚。推测可能与基因的突变与融合、非编码RNA调控和蛋白质翻译后修饰或肿瘤内环境的相互作用有关。

2.3 PDK4与肿瘤凋亡 在肿瘤逃避凋亡的各种因素中，代谢正逐渐成为关键因素之一；且代谢和凋亡途径之间明显存在交叉，PDK4能够通过调节促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的功能来调控肿瘤细胞的凋亡［24］。有研究发现在非小细胞肺癌中，PDK4作为抑癌基因miR382-5p的靶点，可被circ_0005962通过调控miR-382-5p来调控。miR-382-5p通过抑制PDK4的表达促进细胞凋亡。circ_0005962通过海绵作用降低了miR-382-5p的表达，进而激活PDK4的表达，抑制了非小细胞肺癌细胞的凋亡［25］。在SI等［21］研究中发现，miR-9-5p通过抑制PDK4的表达促进了肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及细胞周期进入，同时通过上调Bcl-2的表达和下调凋亡蛋白胱天蛋白酶3和9的蛋白水平抑制肝癌细胞凋亡，从而加速了肝癌的发展。这在一定程度上说明在肝癌细胞中PDK4起到抑癌基因的作用。同样也有研究［26］表明miR-195作为一种抑癌miRNA，能够靶向抑制肝癌细胞HEPG2的PDK4基因进而抑制肝癌的增殖并且促进肝癌的凋亡。CHOINIERE等［27］曾在PDK4基因敲除的小鼠中观察到肝细胞的自发凋亡，这提示PDK4在肝脏凋亡中发挥一定作用，推测线粒体分子的缺失可能激活线粒体损伤检查点导致细胞凋亡。同样在肝癌细胞中，PDK4却有着截然相反的作用，这可能与改变的上游基因不同进而影响了不同的生存或者凋亡通路相关。有研究［28］发现死亡结构域蛋白与PDK4能够进行相互作用，TNF-α等凋亡诱导剂以浓度依赖性的方式诱导HeLa和HepG2细胞凋亡，并抑制PDK4 mRNA水平。这为说明PDK4在触发癌细胞凋亡中起到作用提供了依据。

2.4 PDK4与肿瘤耐药 肿瘤细胞常以极强的适应能力抵抗药物压力并做出相应的“进化”，使得肿瘤耐药成为肿瘤治疗中最常见的制约治疗效果的因素。耐药的分类和机制错综复杂［29-30］并严重影响患者治疗和预后，因此阐明耐药机制，抵抗耐药是提高疗效改善预后的关键。自Warburg效应提出以来，许多研究致力于阐明有氧糖酵解与癌症之间的联系。除前面提到的其与肿瘤增殖、转移、凋亡之间的联系外，这种代谢转换也通过葡萄糖转运体的介导、糖酵解酶活性的改变、生存信号的激活等方面促进化疗耐药性［31］。WOOLBRIGHT等［32］的研究发现，PDK4在膀胱癌细胞株中表达上调；在顺铂耐药的膀胱癌中联合使用PDK抑制剂和顺铂会明显抑制细胞增殖，且在异种移植小鼠模型中观察到明显的肿瘤坏死。耐药宫颈癌细胞［33］通过上调PDK4介导了有氧糖酵解；当敲低PDK4或通过miR-16-5p下调PDK4可使耐药宫颈癌细胞对阿霉素（Dox）敏感。同时异种移植模型也证实，抑制PDK4表达可以提高阿霉素治疗模型动物肿瘤效果，内在具体机制尚未解释清楚，推测PDK4可能通过调节糖酵解酶活性并激活相关生存通路促进了有氧糖酵解在化疗耐药中的作用。此外，PDK4还参与到耐药肿瘤细胞干细胞性的维持，FEKIR等［34］研究发现肝祖细胞向更不成熟的具有干细胞特性的细胞进行反向分化，会增加化疗耐受性。对顺铂和索拉非尼耐药的人类肝癌细胞具有干细胞特性，并且发现PDK4有助于这种干细胞特性的维持并参与耐药。推测其机制可能是通过PDK4抑制线粒体PDH复合物的激活来增强化疗耐药性。SONG等［35］研究发现葡萄糖决定了人胰管癌细胞对药物抑制系统xc（-）诱导的铁死亡的敏感性。PDK4被鉴定为铁死亡抗性的驱动因素。PDK4不仅能通过阻断丙酮酸脱氢酶依赖的丙酮酸氧化来抑制铁死亡，还能通过抑制丙酮酸氧化和脂肪酸合成来调控对铁死亡诱导剂的代谢抗性。一项关于胶质瘤对泛极光激酶抑制剂托扎舍替（tozasertib）抗性机制的研究［36］发现 PDK4基因显著上调，且与托扎舍替诱导的耐药性呈正相关，提示PDK4可能是托扎舍替耐药表型的一个选择性靶点。关于PDK4与肿瘤耐药关系的研究多数仍停留于表型阶段，并多集中于证明耐药细胞中PDK4的表达水平以及改变PDK4水平后耐药性的变化，至于探索其内在机制还需结合更多基因间相互作用的研究和探索。

3 PDK4与肺癌耐药

耐奥西替尼、吉非替尼等药物的肺癌已是临床常见，众多miRNA靶向治疗逆转肺癌耐药的研究也十分广泛［37-38］，有关PDK4与肺癌耐药关系的研究虽少却新颖。YU等［39］发现PDK4的上调促进肿瘤细胞在体内和体外的生长并与肺腺癌患者获得化疗耐药直接相关。作者此前一项研究［40］表明PDK4通过调节内皮PAS结构域蛋白1（endothelial PAS domain protein 1）的转录调控来促进肺腺癌细胞的生长和顺铂耐药，并且肺腺癌临床样本中PDK4上调与患者较差的临床结局有紧密联系。与之相反的是，PDK4也可以作为一种抑癌基因，在肿瘤细胞上皮-间质转化与耐药性之间起到桥接的作用，SUN等［41］发现通过敲除PDK4能够驱动上皮间质转化并促进表皮生长因子突变的肺癌细胞对厄洛替尼的耐药。一项研究发现FoxO3a可能通过直接与PDK4启动子区域结合使PDK4的表达降低，从而削弱有氧糖酵解的效应，减小了非小细胞肺癌对吉非替尼的耐药性。这表明PDK4在NSCLC耐表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂中具有促进作用［42］。尽管目前对于PDK4与肺癌耐药之间的研究十分有限，但就已有的研究来看，PDK4极有可能作为逆转肺癌耐药的一个潜在靶点。

4 PDK抑制剂

PDKs能够磷酸化PDH中丙酮酸脱氢酶E1α亚单位上的丝氨酸残基Ser293、Ser300和Ser232使丙酮酸脱氢酶复合物失活，阻止丙酮酸通过线粒体的氧化代谢，通过促进有氧糖酵解途径来促进癌细胞的增殖［43］。最早应用于临床的代谢抗癌药物二氯乙酸（dichloroacetic acid，DCA）是一种作用于丙酮酸结合位点的抑制剂，能够逆转Warburg效应，可以诱导ROS的产生并有效降低癌细胞的增殖［44］。有研究表明DCA能够增加耐药肺癌细胞对紫杉醇的敏感性。CPT［45］作为一种新的PDK4抑制剂，抑制了人胰腺癌和结直肠癌细胞系中PDH的磷酸化，以及肿瘤细胞的增殖。尽管DCA和其他PDKs抑制剂在体外肿瘤实验中显示出强大的抑制效应，但仍然不清楚个体PDKs的作用以及PDKs增强化疗耐药性或诱导细胞死亡的潜在机制［46］。

5 总结与展望

PDK4作为PDKs家族重要一员，通过调节细胞代谢途径，磷酸化PDH，促进肿瘤细胞的有氧糖酵解，在多种肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和转移以及耐药中起着重要作用，因而成为一种新颖的癌症治疗靶点，PDKs家族与肿瘤间相互作用的研究逐渐成为热点，各种PDKs抑制剂也不断面世，尽管并未成功应用于临床，但在体外研究方面的进展已经十分可喜，未来可能通过更多PDK4特异性抑制剂的开发与安全性检验，用于多种癌症的特异性治疗及促进肿瘤耐药逆转并真正在临床意义上为癌症群体的治疗和预后提供新的方案。